1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
CIPK（CBL-interaction protein kinase）编码的蛋白激酶作为植物Ca2 信号转导过程中的关键元件，在植物抵抗生物与非生物胁迫过程中发挥重要作用。本实验室前期在簇毛麦中克隆了一个类钙调素互作蛋白激酶基因Hv-CIPK1，为验证其激酶活性，本课题构建BRI1（brassinosteroid insensitive 1）[1]的胞外结构域与Hv-CIPK1激酶结构域野生型和关键氨基酸位点突变型的融合表达载体，载体自带GFP基因，将表达载体通过PEG介导法转入小麦的原生质体中，再用BR处理转化细胞。通过统计活细胞占总细胞数的比例及分析，验证目标基因的激酶活性并鉴定激酶活性必需的关键位点，旨在建立一个基于原生质体表达的小麦激酶活性验证系统。
钙调磷酸酶-B类似蛋白(Calcineurin B-like protein, CBL)是植物特有的Ca2 识别受体蛋白,通过激活CIPK激酶蛋白,进而磷酸化修饰下游靶分子,启动下游一系列响应机制[2]。
在模式植物拟南芥中,有关CIPK在响应非生物逆境胁迫中功能的研究报道较多。然而,在重要的粮食作物小麦中,目前已经利用生物信息学方法成功鉴定了79个TaCIPK基因，对小麦CIPK家族进行了基因鉴定与分析[3]，但是对功能的研究较少，除了发现一个小麦CIPK基因（WPK4）[4]参与细胞分裂素以及光合营养信号转导外，对于具体激酶活性的研究尚未开展。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：构建目标基因与BRI1基因的融合表达载体，利用小麦原生质体系统，验证Hv-CIPK1激酶活性功能，初步建立基于小麦原生质体的激酶活性验证系统。
研究内容：研究对象为在簇毛麦中克隆出的Hv-CIPK1片段，以pAN580为骨架，将Hv-CIPK1基因片段（两个野生型，一个突变型）与BR1基因连接构建载体，转入大肠杆菌感受态，提取质粒。种植南农9918种子作为提取原生质体苗，制备南农9918的原生质体，将目标质粒和580空载 转化进入原生质体作为对照，用油菜素内酯BR处理，统计原生质体活性。
拟解决的关键问题：Hv-CIPK1关键激酶域需要用SMART分析法得出具体区间，激酶活性如何表达，需要构建BRI1（brassinosteroid insensitive 1，膜上的受体激酶，对油菜素内酯BR不敏感）的胞外结构域与Hv-CIPK111激酶结构域野生型和关键氨基酸位点突变型的融合表达载体，同时融合GFP作为报告基因。关于原生质体提取的具体步骤和注意方法，原生质体提取的效率会很大程度上影响实验结果。本研究将进一步解决这些关键问题，直至建立一个基于原生质体表达的小麦激酶活性验证系统。
3. 研究的方法与方案
研究方法：前期阅读文献，并通过生物信息技术，运用SMART分析得出Hv-CIPK1基因激酶域所在具体区间，得到激酶域序列，在簇毛麦中克隆然后PCR扩增激酶域，人工合成关键氨基酸位点突变的Hv-CIPK激酶域序列，在下一步实验中，野生型与突变体对比，显示激酶活性。然后，用pm580作为骨架，构建BRI1（brassinosteroid insensitive 1，膜上的受体激酶，对油菜素内酯BR不敏感）的胞外结构域与Hv-CIPK1激酶结构域野生型和关键氨基酸位点突变型的融合表达载体，同时融合GFP作为报告基因,通过PEG法介导转入小麦的原生质体中，再用BR处理转化细胞,统计活细胞占总细胞数的比例。
技术路线
4. 研究创新点
关于CIPK的研究，大都在拟南芥和水稻中中进行，关于小麦CIPK基因的研究甚少，对于激酶活性的研究小麦中这是第一次，如果能成功建立激酶活性验证系统，对于小麦抗逆性的研究有重大意义。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2018.7.14-2018.7.20：上网查文献，了解相关背景
2018.7.21-2018.7.30：完成文献综述的写作
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