1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪是我国重要的经济动物，商品猪的生长性能是其重要的经济性状，而其中最重要的生长性状是日增重。日增重性状较好的猪能在更短的时间内达到市场目标体重，即上市体重，从而能节省很大的饲喂成本。日增重是地方猪和含地方猪种血缘的培育猪种的劣势性状，也是其遗传改良中十分重要的经济性状，提高种猪的日增重可以缩短商品猪的育肥时间，节约饲料及人工成本。
已有研究表示，分子育种技术有助于改善商品猪的日增重性状。已有研究证实几种主效基因和数量性状基因座（QTL）显著影响日增重性状，基于这些基因和QTL的育种技术已使得商品猪的日增重性状显著改善[1]。目前国内外在猪的日增重试验研究中发现胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)对仔猪的早期生长及肌肉发育具有重要促进作用。Kirkpatrik[2]发现，在IGF1基因上有两个HhaI酶切位点，其中之一能产生多态位点。Cases-carrillo[3]的研究发现，IGF1的不同基因型间断奶日增重在不同的公猪家系之间存在明显的差异（32g/d），并且提出了在IGF1和Sw1071之间存在一个影响的QTL的假设。除此外，国内也有很多研究发现，对于日增重、瘦肉率以及骨、皮、脂含量等性状与IGF1基因位点的多态性相关性是显著的(P0.05)[4]。对于猪初生重、6月龄重及瘦肉率，与IGF1基因位点多态性也有显著相关性(P0.05)[5]。还有文献显示胰岛素样生长因子2(insulin-likegrowthfactor2, IGF2)又称生长介素A(somatomedinA)也是影响日增重性状的主效基因，影响肌肉生长以及分化。虞德兵[12]和刘鑫[13]的研究中都有证明IGF2基因与猪生长性状有显著相关。还有研究[14]提出假设IGF1基因和IGF2基因可能是通过一个受体联合发挥的作用。有研究发现黑素皮质激素受体4 (Melanocortin-4 Receptor, MC4R)，是调节人类肥胖机制的重要因子。大量分布于中枢神经系统的各个区域，如大脑皮质、脑干、下丘脑等，MC4R在下丘脑腹内侧核高密度分布 [6]，并证明与调节摄食行为及体重高度有一定关联。Kim[7]发现在猪MC4R基因中有一高度保守区，当发生错义突变(G→A)后TaqI酶切位点也随之改变，猪中这一突变使得MC4R蛋白第298位氨基酸天冬氨酸(Asp)被天冬酰胺(Asn) 所替代，部分猪种的背膘厚，生长速度及饲料摄入与这一突变有显著相关性。经查阅文献，已有研究表明氟烷基因（ryanodine receptor,RYR1）与猪生长有明显的相关性[9]，扬名等[9]研究发现，RYR1基因在皮特兰群体中与背膘EBV显著相关，NN型个体在生产性能日增重质量方面表现明显优势。Park等[10]研究发现nn型猪只的平均体重较NN型低67g。另外通过文献还发现椎骨发育相关基因（vertebrae development associated, VRTN）是影响猪脊椎数变异的基因，同时也有报道该基因与猪只生长速度显著相关[11]。猪VRTN基因中存在一个短散在重复序列(shortinterspersedrepeatedsequence,SINE)的插入多态,该多态可能与猪的脊椎数关联。陈伟等[12]研究结果表明,引入品种SINE 频率高于培育猪种和中国地方猪种,且大白猪SINE / 个体100kg体重日龄显著高于SINE-/-个体(P0.05)。
然而目前大多关于猪日增重性状的主效基因研究主要集中于“洋猪”，如洋三元杂交体系猪群。由于外来种猪具有生长速度快、瘦肉率高、体型好等优势，使得其在我国的养殖户和养殖企业中十分受欢迎。我国地方猪种和含地方血缘的培育猪种生长速度慢、瘦肉率低，体型优势不明显，但是其具有肉质好、繁殖性能高、杂交优势明显、抗病耐粗饲等优点[8]。目前生产者对养殖效率要求不断提高，消费者对于产品质量的要求越来越高，需在保证肉质的同时，提高日增重，所以地方猪种及培育猪种的日增重选育也显得更为必要。
2. 研究的基本内容和问题
（1）研究目标：分析候选基因RYR1基因和VRTN基因与苏淮猪日增重性状的关联性。以期为苏淮猪选育提供新的分子辅助育种标记。
（2）本研究以苏淮猪为研究对象，选择RYR1基因和VRTN基因为调控苏淮猪日增重的候选基因，通过测定100头试验猪160日龄与35日龄的活体重来计算出苏淮猪的日增重，并采集耳样组织，于实验室中提取DNA，设计RYR1基因和VRTN基因的引物，在苏淮猪群体中进行两个基因分型，将基因分型结果与测量所得平均日增重进行关联性分析，来验证其关联性。
（3）拟解决的关键问题：候选基因与日增重性状的关联性分析。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法及技术路线
本实验对象为335头苏淮猪，养殖试验期测得35日龄以及160日龄的体重值以求得平均日增重，并采集耳样带回实验室用试剂盒进行DNA提取，利用primer6.0对RYR1基因和VRTN基因进行引物设计，进行PCR反应并测序，通过DNAMAN软件对测序结果候选基因进行对比，查看RYR1基因的rs344435545位点，VRTN基因的因果突变位点NV123是否在苏淮猪群体内存在插入突变，并利用CHORMA软件对候选基因进行分型。通过SPSS软件的单因素方差分析检验RYR1基因和VRTN基因是否与日增重具有显著关联，找到用于苏淮猪日增重选育的分子标记。
2.实验方案
2.1实验目的
（1）（1）将RYR1基因和VRTN基因分型结果与测量所得平均日增重进行关联性分析，看是否有显著关联性；
（2）（2）通过关联性分析的结果，以望获得对于苏淮猪分子辅助育种新的标记；
（3）2.2实验动物及实验器材
（4）实验动物品种：苏淮猪
（5）实验动物数量355头
（6）实验器材：耳样采集器，75%乙醇，酒精棉球，称重仪，分析天平、PCR仪、试剂盒
2.3实验方法及步骤
本实验对象为355头苏淮猪，养殖试验期测得35日龄以及160日龄的体重值以求得平均日增重，并采集耳样；
（1）将采集的耳样带回实验室用试剂盒进行DNA提取；
（2）对RYR1基因和VRTN基因引物设计及合成；
（3）进行PCR反应，基因分型后进行数据统计及关联性分析；
（4）得出关联性分析结果。
3.样品采集及测定方法
3.1样品采集与保存：利用耳号钳剪取已经利用体积分数为75%的乙醇溶液消毒过耳尖的待检猪只耳样2-3g,放入1.5mL装有体积分数为75%的乙醇溶液的离心管内，–80℃条件下保存。
3.2DNA提取：根据TaKaRaMiniBESTUniversalDNAExtractionKit(宝生物工程(大连)有限公司)提取上述猪耳组织，将获得的DNA经琼脂糖凝胶电泳及NanoPhotometer进行DNA质量的检测，然后于-20℃保存备用。
3.3引物设计及合成：
表1RYR1及VRTN基因引物序列
| 基因 | 引物序列 |
| RYR1 | F 5' CCGACTTCTCACCCCTTG 3' |
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| R1 5' GGGTGGTGGAGGGTTCTA 3' |
| VRTN | F 5’-GGCAGGGAAGGTGTTTGTTA-3 |
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| R 5’-GACTGGCCTCTGTCCCTTG-3 |
3.4 PCR扩增：PCR扩增反应体系为20μL:其中DNA模板1μL(30ng/μL)，上、下游引物(10pmol/μL)各1μL,2×TaqMix10μL,7μL的去离子水。反应程序为:94℃预变性,5min;94℃变性,40s;60℃退火40s;72℃延伸30s,变性、退火、延伸35个循环,循环结束后,72℃最终延伸10min,最后在4℃保存。3.5基因型与日增重性状关联性分析分析：采用SAS软件中的一般线性模型进行日增重和基因型的关联性分析，检验候选基因位点是否与苏淮猪日增重显著关联。
4. 研究创新点
（1）现有相关实验分析主要集中于“洋猪”，而对于地方猪种的选育研究相对较少，而本实验采用含有地方血缘的培育品种品种苏淮猪为试验对象，为地方猪种的选育提供更多科学依据。
候选基因选择方面，本试验选用的RYR1基因和VRTN基因为候选基因，该两种基因的研究较多，但是对于与苏淮猪日增重性状的关联性分析较少，本研究可为苏淮猪的分子辅助育种提供新的标记。
5. 研究计划与进展
养殖试验于2019年5月份在江苏省淮安市淮阴种猪场进行，预计于2019年9月份完成养殖实验并采样。确定了养殖计划，明确了养殖方案及样品采集方案。
实验预期进展：
2019年5月 查阅文献、设计实验、申报项目、前期准备
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