毛冬青化学成分的提取分离与结构鉴定开题报告

 2022-12-28 10:22:50

1. 研究目的与意义

内容:通过利用反复硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶柱色谱法、高压快速制备色谱及半制备高效液相色谱等方法靶向分离纯化，通过理化常数、薄层色谱、红外、NMR、MS 等方法鉴定化合物结构等方法，从而阐明毛冬青（Ilex pubescens）根的药效物质基础。

意义：毛冬青是南方常用的民间中草药，其主要用药部位为三萜皂苷类化合物，目前已广泛应用于治疗心脑血管疾病，最新研究发现毛冬青可以缓解炎症，扩张血管和抑制血小板聚集等。近几年从毛冬青中也分离出多种单体化合物，具有很好的生物活性，然而毛冬青化学成分仍然有待进一步挖掘，许多疑问仍有待解决，需不断将中药学理论结合现代先进的医药科技手段进行多方面的实验研究和探索，加强临床应用和效果评价，从而促进毛冬青的进一步研究与开发利用。

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2. 文献综述

毛冬青化学成分的研究进展

摘要：毛冬青为冬青科（Aquifoliaceae）冬青属植物Ilex pubescens，毛冬青又名乌尾丁、六月霜、细叶冬青等。生于山野坡地、丘陵等灌木丛中。主产广东、广西、安徽、福建、浙江等地。主治清热解毒、活血通络等。

毛冬青作为中药使用历史悠久，曾收载于1977年版《中国药典》。其中毛冬青甲素（毛冬青酸的半合成衍生物）因其在治疗心血管疾病方面有较好的活性而被广泛关注。为了促进毛冬青的研究与进一步开发利用，本文对毛冬青化学成分研究进展及毛冬青的药理作用进行了综述，并对其开发利用进行了展望。

关键词：冬青属；毛冬青；化学成分

Research Progress on Chemical constituents of Ilex pubescens

Abstract:Ilex pubescensbelongs to Aquifoliaceaeis alsoknown as Umsurea, June frost, holly, woolly cloak, and so on.It usually grows on hillsides, hills and other shrubsand mainly distrubuted in provinces such as Guangdong, Guangxi, Anhui, Fujian, and Zhejiang. Its activity include clearing heat and detoxifying, activating blood circulation and clearing collaterals.

Ilex pubescenshas a long history as a traditional Chinese medicine, which was collected in 1977 edition of Chinese Pharmacopoeia.Among them, Iexonin A(a semi-synthetic derivative of Ilexolicacid) has attracted wide attention because of its good activity in the treatment of cardiovascular diseases.In order to furtherthe research and utilization of Ilex pubescens, this paper reviewed the research progress of chemical constituents and pharmacological effects of Ilex pubescens. Furthermorethe prospect advance of Ilex pubescenswasforecasted.

Key words:Aquifoliaceae;Ilex pubescens;chemical constituents

一、化学成分分类

根据文献报道，毛冬青的主要活性成分为三萜皂苷类和黄酮类，此外还包括木脂素类、酚类、环烯醚苷萜、香豆素类、甾体、氨基酸、鞣质和还原糖等60多种化合物[1]。本文重点介绍三萜皂苷类、木脂类和环烯醚萜苷类化合物，并将已从该植物中分离得到的主要化学成分归纳如下：

（一）三萜皂苷类：

目前，皂苷类化合物是毛冬青中分离得到最多的化合物，其中包括乌苏烷型和齐墩果烷型以及羽扇豆烷型的五环三萜，并以乌苏烷型三萜为主，具体见下表：Table 1Triterpenesisolated from Ilex pubescens

Type

No.

Name

R1

R2

Ref.

Ⅰ

1

ilexolide A

xyl

H

2-3

2

ilexsaponin B

xyl

glc

4

3

pubescenoside C

glc(1→2) xyl

glc

5

4

pubescenoside D

rha(1→2) glc(1→2) Xyl

glc

5

5

Pubescenoside E

glc(1→2) xyl

H

6

Ⅱ

6

ilexsaponin B1

glc (1→2)Xyl

H

4-5,7

7

ilexoside A

xyl

glc

8

8

ilexsaponin B2

rha(1→2) glc(1→2)xyl

H

5, 7

9

ilexsaponin B3

glc(1→2)xyl

glc

5, 7

10

ilexoside O

rha(1→2) glc(1→2)xyl

glc

8

11

ilexgenin B 3-O-β-D-xylpyranoside

(prosapogenin A)

xyl

H

8,9

Ⅲ

12

pedunculoside

H

glc

2

Ⅳ

13

ilexsaponin A1

H

glc

10-11, 3

14

6'-O-acetyl-ilexsaponin A1

H

6'-O-Ac-gluA

12

15

Ilexpublesnin A

Xyl

Glc

13

16

Ilexpublesnin B

H

Xyl2-Glc

13

Ⅴ

17

ilexsaponin B4

ara(1→2) glc(1→2)xyl

H

14

18

Pomolic acid

H

H

6

Ⅵ

19

3-O-β-D-xylopyranosyl spathodic acid 28-β-D-glucopyranosyl ester

xyl

glc

9, 14

Ⅶ

20

chikusetsusaponin Ⅳa

gluA

glc

5

21

Acetyloleanolic acid

CH3CO

H

6

Ⅷ

22

3β-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl]-urs-20-en-28-oic acid

glc(1→2)xyl

H

15

IX

23

3-O-a-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-glucopyranosyl-(1→3)]-a-arabinopyranosyl hederagenin

rha-(1→2)-[glc-(1→3)]-ara

H

6

X

24

ilexsaponin D

xyl

H

16

xyl=-β-D-吡喃木糖, glc=-β-D-吡喃葡萄糖, rha=-а-L-吡喃鼠李糖, ara=-β-D-吡喃阿拉伯糖 gluA=glucuronic acid.

Figure 1 Aglycone sturctures of saponins isolated fromIlex pubescens

类型Ⅰ

类型Ⅱ

类型Ⅲ

类型Ⅳ

类型Ⅴ

类型Ⅵ

类型Ⅶ

类型Ⅷ

类型Ⅸ

类型X

（二）环烯醚萜类

杨鑫[17]等对毛冬青70%乙醇提取物进行系统分离，得到7个环烯醚萜类化合物；杨燚[18]等对毛冬青70%乙醇提取物的乙酸乙酯提取物进行分离纯化得到7个环烯醚萜类化合物,共分离出12种化合物（详细见下表）。

Table2Iridoid glycosides isolated from Ilex pubescens

No.

Compound

Ref.

25

oleoside 11-methyl ester

17

26

oleoacteoside

17

27

oleuroprin

17

28

(R)-β-hydroxyoleuropein

17

29

(8Z)-ligstroside

17

30

(8E)-nuezhenoside

17

31

2'-(3',4'-dihydroxyphenyl)-ethyl-(6"-O-oleoside-ll-methyl ester)-β-D-glucopyranoside

17

32

7″-epifraxam-oside

18

33

(7″S)-7″-ethoxyoleuropein

18

34

(7″Ｒ)-7″-ethoxyoleuropein

18

35

(7″S)-7″-methoxyoleuro-pein

18

36

(7″Ｒ)-7″-methoxyoleuropein

18

Figure 2Structures of iridoid glycosides isolated from Ilex pubescens

25

26

27 R1 = OH R2 = H

28 46 R1 = R2 = OH

29 R1 = R2 = H

30 R = H

31 R = OH

32

33

34

35

36

（三）木脂素类

毛冬青中含有丰富的木脂素类化合物，目前已报道的木脂素类化合物下表所示：

Table 3 Lignans isolated fromIlex pubescens

Type

No.

Compound

R1

R2

R3

Ref.

I

37

liriodendrin

Glc

Glc

--

19

38

acanthoside B

Glc

H

--

14

39

syringaresinol

H

H

--

20

II

40

tortoside A

Glc

H

--

19

III

41

( )-medioresinol di-O-β-D-Glucopyranoside

Glc

Glc

OCH3

21

42

( )-pinoresinol-4,4'-O-bisglucopyranosie

Glc

Glc

H

21

IV

43

(-)-olivil

H

---

---

19

44

(-)- olivil-4'-O-β-D-glucopyranoside

Glc

---

---

21

V

45

( )-cyclo-olivil

Glc

---

---

19

46

( )-cyclo-olivil-6-O-β-Dglucopyranosi-de

H

---

---

21

VI

47

(7S,8R)-dehydrodiconifervl alcohol-

4-O-β-D-gluco- pyranoside

Glc

---

---

21

VII

48

(7S,8R)-dihydrodehydrodiconifervl alcohol-

4-O-β-D- glucopyranoside

Glc

---

---

21

VIII

49

magnolenin C

Glc

---

---

9

IX

50

1-hydroxypinoresinol-1-β-D-glucoside

---

---

---

21

51

( )-fraxiresinol-1-O-β-D-glucoside

OCH3

15

X

52

ilexlignan A

-

---

---

22

XI

53

7,7′-bis-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-8,8′-dihydroxymethytetrahydrofu-ran-4-O-β-D-glucoside

---

---

---

15

XII

54

arctigenin

---

---

---

6

XIII

55

ilexin C

23

XIV

56

(7R,7R,7R,8S,8S,8S)-4,4-dihydroxy-3,3,3,5-tetramethoxy-7,9:7,9-diepoxy-4,8-oxy-8,8-sesquineolignan-7,9-diol

--

--

--

24

XV

57

Erythro-(7S,8R)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-{4-[(E)-3hydroxy-1-propenyl]-2-methoxyphe-noxy}-1,3-propanediol

CH2OH

--

--

24

58

Erythro-(7S,8R)-guaiacylglycerol-β-coniferyl aldehyde ether

CHO

--

--

24

XVI

59

Erythro-(7R,8S)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-{4-[(E)-3hydroxy-1-propenyl]-2-methoxyphe-noxy}-1,3-propanediol

CH2OH

--

--

24

60

Erythro-(7R,8S)-guaiacylglycerol-β-coniferyl aldehyde ether

CHO

--

--

24

XVII

61

Vladinol D

--

--

--

24

XVIII

62

7S,8R-dihydrodehydroconiferyl alcohol

--

--

--

24

Figure3Sturctures of lignans isolated from Ilex pubescens

类型I

类型II

类型III

类型IV

类型 V

类型 VI

类型 VII

类型 VIII

类型IX

类型 X

类型XI

类型XII

类型XIII

类型XIV

类型XV

类型XVI

类型XVII

类型XVIII

（四）其他化合物

除上述化合物外，毛冬青中还存在的三萜类化合物，如半合成衍生物毛冬青甲素(ilexnin A) [25]、毛冬青酸[2]、熊果酸和齐墩果酸[26]、丁香酸、异香草酸[28]以及β-谷甾醇、胡萝卜苷、umbelliferone和豆甾醇[27]等甾体成分；

橄榄苦苷、8（Z）-女贞子苷、红景天苷[28]、(8E)-女贞子苷[29]、豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等皂苷类成分；槲皮素，金丝桃苷和芦丁等黄酮类化合物[30]；

pubescenodides A，B[31]、ilexpubsides A，B[32]、ilexin A,B[23]、protocatechuic aldehyde[20]、caffeic acid[6]、β-D-mudanoside-A[12]、5-O-caffeoylquinic acid[20]、Hydroquinone[27]、4-O-caffeoylquinic acid[33]等酚性化合物；肌醇[9]和ilex acid A、ilex acid B[34]、ligstroside、wilfordiol B、3,4-二羟基苯乙醇、木樨榄苷-11-甲酯[29]等其它成分。

二、毛冬青的药理作用：

1、对心血管的作用：毛冬青甲素对去甲肾上腺素性急性高血压兔的动脉血压有明显的降低作用[35]。毛冬青甲素对正常营养液的主动脉平滑肌钙离子内流和外流均无明显影响,但对高钾或去甲肾上腺素引起的主动脉平滑肌钙离子内流却有抑制作用，由此说明毛冬青甲素对平滑肌细胞膜上的电位依赖性钙通道和受体操纵性钙通道均有拮抗作用[36]。复方毛冬青可以对氯仿、CaCl 2 诱发小鼠的心律失常起拮抗作用，降低心室颤动的发生率及死亡率[37]。毛冬青正丁醇提取物具有扩血管的作用，这可能与其受体操纵性钙通道，介导内皮合成、释放一氧化氮(NO)、拮抗血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、抑制内钙释放和外钙内流有关[38]。

2、对血小板和血栓的作用：体外实验中，毛冬青总提取物对家兔血凝块有明显的溶解作用。并能减少胶原蛋白 － 肾上腺素诱发血栓形成小鼠急性肺栓塞的死亡数。以及减轻 FeCl 3 颈动脉血栓模型大鼠的血栓的重量[39]。

3、对脑组织的保护作用：曾有学者采用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型研究，实验结果表明毛冬青提取物可以明显降低脑组织含水量,升高超氧化物歧化酶的活性,减少丙二醛的产生[40]。另有研究认为毛冬青甲素可能通过促进缺血侧脑组织GAP243的表达,促进神经元的修复和再生而发挥其神经保护作用[41]。

4、抗炎免疫作用：有学者研究表明毛冬青口服液对能够明显的抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀、蛋清致大鼠足跖肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加及大鼠棉球肉芽肿[42]。毛冬青乙素可能通过垂体肾上腺皮质系统，降低大鼠肾上腺VitC 含量从而发挥其抗炎作用[43]。

5、降脂作用：苦丁茶冬青提取物（EIK）连续ig，可显著降低肥胖大鼠腹部皮下脂肪指数，具消肥的作用[44]。

三、展望：

毛冬青是南方常用的民间中草药，其主要用药部位为其根部三萜皂苷类化合物，目前已广泛应用于治疗心脑血管疾病，最新研究发现毛冬青可以缓解炎症，扩张血管和抑制血小板聚集等。近几年从毛冬青中也分离出多种单体化合物，具有很好的生物活性，然而毛冬青化学成分复杂，许多疑问仍有待解决，需不断将中药学理论结合现代先进的医药科技手段进行多方便的实验研究和探索，加强临床应用和效果评价，使毛冬青这一宝贵药材进一步开发与利用，从而造福于人类社会。

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3. 设计方案和技术路线

1、提取：毛冬青药材粉碎，加 8 倍量70%乙醇加热回流提取 3 次，每次12 h，滤过，合并滤液，浓缩，蒸干，即得药材浸膏。

2、分离：将毛冬青的浸膏称重，硅胶拌样，然后进行反复的硅胶柱层析，此外还结合Sephadex LH-20凝胶柱和半制备液相分离纯化得到单体化合物。

3、确定结构类型：采用现代手段（如 IR、1HNMR、13CNMR、MS）对所分离得到的单体成分进行结构鉴定，并参考各类化合物的光谱规律特征对分得的化合物进行结构解析，明确化合物的结构。

4. 工作计划

2022年1月-2022年3月 查阅文献，完成文献综述及开题报告

2022年3月-2022年4月 毛冬青成分初步分离

2022年4月-2022年5月 对初分后的不同粗成分进行细分，使用硅胶层析、

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5. 难点与创新点

迄今为止已从毛冬青中分离出多种单体化合物，并且具有很好的生物活性，但是毛冬青的药效物质基础仍然有待进一步阐明，许多疑问仍有待解决。所以很有必要利用现代先进的医药科技手段进行多方面的实验研究和探索，加强临床应用和效果评价，从而促进毛冬青进一步的开发与利用。

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