炒山楂药材的质量控制开题报告

1. 研究目的与意义

一 内容

采用HPLC法同时测定炒山楂药材中指标性成分枸橼酸，

建立山楂HPLC指纹图谱分析方法，改进山楂质量控制方法。

2. 文献综述

山楂药材质量控制研究文献综述

南京中医药大学 朱友娟

摘要山楂是现代中医药治疗中常用的药材，产地、采收、加工、炮制等因素影响着山楂药材的有效成分，导致药材质量难以控制。为了在生产过程中保证山楂药材的质量，本课题采用现代分析技术，对山楂药材中指标成分进行系统分析，比较不同产地、不同厂家、不同批次的山楂指标成分之间的差异；建立山楂的HPLC法含量测定方法和指纹图谱，为山楂药材的含量测定和质量控制提供依据。

关键词山楂；柠檬酸；含量测定；指纹图谱；质量控制研究。

山楂为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实^[1]，具有消食积、化滞瘀的功效。山楂最早出自《本草衍义补遗》，为仁果类药食兼备的上等补品。秋季果实成熟时采摘。山楂采得后，横切成厚1.5～3毫米的薄片，立即晒干。功效主要为消食积，散瘀血，驱绦虫。治肉积，症瘕，痰饮，痞满，吞酸，泻痢，肠风，腰痛，疝气产后儿枕痛，恶露不尽，小儿乳食停滞。消食健胃，行气散瘀。用于肉食积滞、胃烷胀满、泻痢腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、心腹刺痛、疝气疼痛、高血脂症^[2]。

1.植物学研究

山里红（大山楂、北山楂、山果子）属于落叶小乔木，高约6米，分枝较多，无刺或有少数短刺，无毛。单叶互生，有长柄，长2~6厘米；托叶镰形，较大，边缘有齿；叶片广卵形或棱状卵形，长6~12厘米，宽5~8厘米，有5~9羽裂，仅下面1对裂片较深，先端短渐尖，基部宽楔形，常稍偏斜，边缘有不规则重锯齿，上面有光泽，下面脉上有短柔毛。初夏枝端或上部叶液抽出伞房花序，有花10~12朵；花梗被短柔毛；花萼5齿裂；花冠白色或稍带红晕，花瓣5，宽倒卵形；雄蕊20个，梨果球形，直径可达2.5厘米，深亮红色，有黄白色小斑色，萼片脱落很迟，先端留一深洼，小核3~5。多生于山坡砂地，河边杂林，北方常有栽培。在东北、华北、西北和山东、江苏、河南等地时有所见。而山楂（酸梅子）与上种相似，只是叶片较小，长5~10厘米，宽4~7.5,3~5羽状深裂，羽裂较上种为深，裂片卵状披针形。果实较上种为小，直径1~1.5厘米，深红色。多生于山坡林缘、河岸灌丛。北方常见栽培。分布于东北、华北及陕西、江苏、河南等地^[3]。于丽艳等^[4-5]认为植物的适生区远大于现在的分布区，山楂种质资源保护与创新研究，可以充分利用国家山楂种质资源圃，将珍贵、珍稀、有价值的资源发扬光大，在深度研究和推广应用中有所作为。

2.山楂的炮制

现代炮制方法中，生山楂拣净杂质，筛去核。炒山楂炮制方法为取拣净的山楂，置锅内用文火炒至外面呈淡黄色，取出，放凉。黎量等^[6]利用机器视觉技术，将传统主观性描述的山楂炮制过程各样品的颜色特征进行了数据化表达，发现山楂炮制过程颜色变化与枸橼酸量、5-HMF量变化显著相关，以颜色作为山楂炮制过程控制指标确有一定的科学性，美拉德反应和焦糖化反应是山楂炮制过程的颜色变化机制之一。蔡琳等^[7]的研究也证明了炮制中，生山楂、炒山楂、焦山楂、山楂炭中有机酸含量逐渐降低，PH值逐渐升高。

3.山楂的鉴定

3.1性状鉴定

山楂为圆形片，皱缩不平，直径1～2.5 cm，厚0.2～0.4 cm。外皮红色，具皱纹，有灰白小斑点。果肉深黄色至浅棕色。中部横切片具5粒浅黄色果核，但核多脱落而中空。有的片上可见短而细的果梗或花萼残迹。气微清香，味酸、微甜。炒山楂形如山楂片，果肉黄褐色，偶见焦斑。气清香，味酸、微甜。焦山楂形如山楂片，表面焦褐色，内部黄褐色，有焦香气。

3.2显微鉴别

山里红果实^[1]横切面外果皮细胞1列，类方形，外被角质层，胞腔含棕红色色素，排列整齐；中果皮极厚，全为薄壁组织，外侧（外果皮下）有1-2列含有棕色色素的薄壁细胞，其内侧广大中果皮薄壁组织中含多数淀粉粒、少数草酸钙簇晶，并有纵横的维管束散在；淀粉粒极小，类圆形或类三角形，直径4-8 m，脐点多呈一字形，单粒或2-3个分粒组成的复粒；草酸钙簇晶直径20-28 m。

本品粉末暗红棕色至棕色。①石细胞较多，成群或单个散在，近无毛或淡黄色；呈类圆形、长圆形、长条形、类三角形或不规则形，直径18-173 m，长约至185 m，层纹明显，孔沟较粗，有分叉，胞腔小，有的含橙黄色物。较小的石细胞有时排列成行，并与纤维相连。②草酸钙方晶散在，或包埋于薄壁细胞的棕色物中，方晶直径13-52 m，也有仅2-5 m的小方晶。③草酸钙簇晶单个散在或存在于果肉细胞中，直径27-41 m，棱角较钝。④果肉薄壁细胞皱缩，细胞界限不清，胞腔内含棕色物，并有淀粉及草酸钙结晶。⑤纤维成束，无色或淡黄色。纤维较长，直径11-36 m，壁极厚，约至 17 m，孔沟不明显或较细密。⑥果皮表皮细胞表面观类多角形、类圆形或长圆形，直径 18-47 m，壁稍厚，胞腔内含棕色或橙红色物。⑦淀粉粒单粒圆球形、类圆形或长圆形，有的一端稍尖突，直径4-12 m，脐点隐约可见，呈点状或裂缝状；复粒常由2-4分粒组成。

3.3理化鉴别

取本品粉末1 g，加乙酸乙酯4 mL，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各4 L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:4:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液（3→10），在80℃下加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点：置紫外光灯（365 nm）下检视，显相同的橙黄色荧光斑点^[8]。

4.山楂的化学成分

山楂中主要含有机酸、酚酸、三萜类、黄酮类、微量元素及氨基酸、黄烷及其聚合物等。现行的2015版药典中采用酸碱滴定法测定总酸含量，虽然该测定法比较成熟，简单易行，但该方法要消耗基准物质和大量的碱液,不适合绿色化学发展的方向,且判断终点时难免有人为的误差不可避免，精确度不高，对实验结果影响较大。枸橼酸是山楂中主要的活性成分之一,在一定色谱条件下检出较好，也是山楂治疗疾病的重要成分,故选择该物质作为考察指标。随着科学技术的发展，高效液相色谱法普及，很多研究者改为采用高效液相色谱法对山楂中的枸橼酸含量进行测定控制其质量。

4.1有机酸

山楂中既含有枸橼酸和苹果酸等水溶性有机酸,又含有熊果酸和齐墩果酸等脂溶性三萜酸^[9-10]。现行的山楂质量控制主要是测定其总酸含量或枸橼酸含量。雷成康等^[11]研究发现以电位滴定法替代指示剂法进行山楂中有机酸含量测定的可行性，具有客观可靠、准确度高、易于自动化、不受溶液颜色、浑浊诸多优点，枸橼酸和山楂的滴定过程均有明显突跃。李仁秋等^[12]建立高效液相色谱法测定山楂合剂中枸橼酸的含量，方法简便、快速、专属性强、重现性好，刘冬雪等^[13]的研究也证明了这一方法的可行性。金高娃等^[14]以反相高效液相色谱法测定山楂中的有机酸含量。Qi C等^[15]采用高效液相色谱法(HPLC)和二极管阵列检测器测定各化合物的含量。Liu P等^[16]采用聚酰胺柱层析法分离、高效液相色谱法结合二极管阵列紫外光谱法和电喷雾电离质谱法进行分析、紫外光谱、质谱和参比鉴定酚类化合物，鉴定出多种苷元。

4.2黄酮类成分

黄酮类是山楂降血压、降血脂、增加冠脉流量、抗心律失常的有效成分^[17]，张书华等^[18]以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法在500nm波长处测定总黄酮含量，标准曲线法计算南山楂中总黄酮的含量。孙立立等^[19]采用比色法建立以金丝桃苷为对照品的山楂黄酮含量测定方法和含量限度标准。其主要苷元为芹菜素(Apigeni)、山奈酚类(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、槲皮素类(Quercetin)及二氢黄酮类(Bi－hydroflavonoids)等^[20-23]。Kowalewski Zdzislaw等^[24]从山楂叶中分离得到了多种新型苷元。

4.3其他成分

黄锁义等^[25]用原子吸收分光光度法测定5种山楂中的Zn、Cu、Mn、Fe、Co、Ni、Cd、Pb、Cr、Sr、Ca、Mg、As等13种微量元素。孙树英等^[26]采用酸解法提取山植叶中无机元素，提取液用ICP-AES测定,山植叶中含有17种微量元素，这些元素的存在是山植叶能用于治疗多种疾病的内在因素之一。关爱年等^[27]对吉林省内栽植的十一个山楂品种果实进行了氨基酸的分析，在测试的品种中含16种氨基酸和7种人体必需氨基酸。

5.山楂的药理作用

5.1对消化系统的作用

山楂在中药学中属于消食药，促进消化作用山楂含有脂肪酶，能促进脂肪消化，并能增加胃消化酶的分泌，促进消化。张三印等^[28]通过对大鼠和家兔离体胃肠实验，各山楂炮制品对离体胃肠肌条均有促进收缩作用，主要通过增高胃肠平滑肌的振幅，而对收缩频率影响不大。温小萍等^[29]研究发现山楂水提物(20mgmL-1)可加强乙酰胆碱引起的肠平滑肌的强烈收缩,对抗阿托品引起的肠平滑肌的舒张作用，表明山楂水提物对大鼠胃、肠平滑肌条的收缩具有显著的刺激作用。武蕾蕾等^[30]发现山楂水提物可以通过抑制IBS大鼠结肠黏膜5-HT和5-HT3R表达，进而减弱神经介导的胃肠道运动与分泌，提高内脏痛阈，消除肠道过敏。

5.2对心血管系统的作用

山楂内所含的三萜酸能改善冠脉循环而使冠状动脉性衰竭得以代偿，达到强心作用，山楂可增加冠脉流量，降低心肌耗氧量，对心肌缺血、缺氧有保护作用。同时，实验表明，山楂有较持久的降压作用。郭娜等^[31]发现山楂醇提物灌肠对于辐射损伤小鼠的造血系统具有较好的保护作用，能够减小白细胞、红细胞及血小板等指标的下降趋势。Tauchert M^[32]证实山楂提取物WS 1442对心力衰竭患者的运动能力及典型的心力衰竭相关临床症状和体征存在剂量依赖效应。

5.3降脂作用

葛志英等^[33]用山楂为主药的中药复方水煎液喂服动脉粥样硬化模型的家兔,以非诺贝特喂服同样的家兔作对照，结果表明此复方有降低血清总胆固醇、甘油三脂的作用，且复方煎剂组与对照组相比，动脉粥样硬化病变数量明显减少，表明山楂有抗实验性动脉粥样硬化的功效。刘莹等^[34]发现山楂能调节血脂代谢，具有明显的降血脂作用和预防动脉硬化作用，在大鼠连续14 d灌服脂肪乳剂后，可形成高脂血症和肝脂肪变，在给予脂肪乳剂的同时给予丹参山楂提取物，则可明显减少大鼠血清TC、TG、LDL、LDL-C、TC/HDL-C比值及肝重量系数的增加，防止HDL-C的降低及肝脂肪变的形成。

5.4抗氧化作用

努尔阿丽耶阿卜力米提等^[35]以还原力、清除羟基自由基和清除DPPH自由基的能力测定山楂水和醇提物的抗氧化性能，发现新疆山楂提取物对羟基自由基和DPPH自由基均具有一定的清除作用，且醇提物的抗氧化能力强于水提物的。王玉荣等^[36]的研究表明从新鲜山楂果肉、全果中提取的多糖，主要成分是酸性多糖，并含有部分中性多糖、还原性多糖以及少量蛋白质，对DPPH和OH自由基有一定的清除能力。

5.5对免疫功能的作用

金治萃等^[37]用100%山楂煎剂以0.2 ml/10 g体重给小鼠灌胃，证实山植煎剂和构祀煎剂对小鼠红细胞C3b受体花环率及红细胞免疫复合物(lC)花环率均有显著的增强作用,对小鼠红细胞免疫有明显的促进作用。周蔷^[38]通过LPS刺激致使大鼠免疫应激，血清IL-1、TNF-α含量明显上升，用药后血清IL-1含量有所下降，TNF-α含量趋于正常。山楂的水煎醇沉制成的注射液皮下注射给药连续9d,可使家兔血清溶菌酶活性、血清血凝抗体滴度、心血T淋巴细胞E玫瑰花环形成率及T淋巴细胞转化率均显着增强，提示有免疫增强作用。

5.6抗菌作用

山楂对志贺痢疾杆菌、福氏痢疾杆菌、宋内痢疾杆菌等有较强的抗菌作用；对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌。大肠杆菌、变形杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌等也有抗菌作用；一般对革兰阳性细菌作用强于革兰阴性细菌^[1]。申笑菡等^[39]研究表明金黄色葡萄球菌对山楂叶提取物较为敏感，5 mg的山楂叶乙醇纯化提取物与30 g的万古霉素抑菌作用相当。山楂叶提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.625 mg/mL。

5.7防癌作用

马蕾^[40]发现山楂多糖提取物处理细胞不同程度降低Ki-67蛋白染色，山楂多糖提取物处理显着降低P-AKT蛋白表达。山楂多糖提取物显著增加凋亡细胞比例，用山楂多糖提取物处理的HCT116细胞显著增加caspase3,caspase7,caspase8和caspase9的表达，山楂多糖提取物还以剂量依赖性方式上调FADD,TRADD和TNFR1的mRNA水平，表明山楂提取物作为癌症患者的功能性食物有很大的潜在益处。山楂所含黄酮类药效成分中,牡荆素具有抗癌作用。山楂中某些活性多糖有抗肿瘤和增强免疫功能的作用^[41]。

6.质量控制

6.1质量标准

我国中药长期以来为各族人民的生存繁衍与发展做出了巨大贡献，现已成为国家重要的战略资源。中药材的质量与其质量控制是人们长期关注的重要问题，事关临床用药的有效性与安全性，也是相关开发生产工作的基本问题，事关研究工作的科学性、有效性及结果的可靠性。随着人们对山楂研究的深入，山楂药用的范围越来越广泛，我们需要选取质量控制合理目标物和指标。

一种中药材有效成分是多样的，但适合作为指标成分的物质却是极少的。杨书斌等^[42]人首次从山楂中分离出牡荆素鼠李糖苷,并确定了立体结构。证实牡荆素鼠李糖苷是山楂的专属性成分,建立了定性的鉴别方法和对金丝桃苷的含量进行测定的分析方法,以及中药山楂的规范化质量标准。陈宝龙等^[43]为了控制山楂的质量，采用毛细管电泳法建立山楂药材黄酮类成分的指纹图谱，结果表明该方法可用于控制山楂药材质量。杨滨等^[44]的实验认为在现行的色谱条件下,山楂样品中可检出苹果酸和构椽酸;但苹果酸的保留时间太靠前,草酸的峰与溶剂峰保留时间相同,不宜用来定量;琥珀酸的峰未检出，所以选择枸橼酸进行定量分析。

本课题经过比较多种质量控制方法，考虑多方面的因素，最终选择具有分离速度快、分离效率高、检测灵敏度高等优点的高效液相色谱法测定山楂中柠檬酸的含量，作为其质量控制方法。

6.2指纹图谱

中药指纹图谱是指中药材或中成药经过适当处理后，采用一定的分析测试技术，得到的可以标志该中药材或中成药特征共有峰的色谱或光谱图谱，为中药或中药系列产品质量稳定性的控制等方面提供研究方法和思路。不同的品种、环境因素的不同、植物的处理方式不同、提取方式不同、故意或偶然的掺假情况、易混淆植物的混滑使用都会导致中药材质量的差异，这表明中药的鉴别和质量控制十分重要，而结合指纹图谱技术能够更加全面的控制中药质量^[45]。

龙凤等^[46]通过不同检测条件进行筛选比较，建立了山楂药材高效液相色谱

指纹图谱共有模式，共标示出12个共有峰，方法稳定、重复性好，可为评价山楂药材的质量提供方法依据。胡玉珍等^[47]通过实验用UPLC法建立了多个产地山楂的指纹图谱，将黄酮类成分纳入山楂的质量控制指标性成分，补充完善了2015版药典仅以有机酸为标准的缺陷，对于山楂药材质量控制的改善和标准的建立有重要的意义。汤树良等^[48]比较多种条件下建立指纹图谱，结果以甲醇为提取溶剂时,色谱峰峰数多、峰面积值大、整体基线好，以冷浸12 h后超声30 min所出图谱各峰相对峰面积值最大。

本课题采用高效液相色谱法，建立炒山楂药材指纹图谱，对鉴别真伪、控制产品质量的稳定性、保证中药的临床治疗功效有一定的现实指导意义。

7.小结

药材质量标准制定的目的是为了保证临床疗效，是为了稳定药材的物质组成。已经有许多研究者对山楂药材质量控制作出了一系列的研究，本课题选择柠檬酸作为质量控制指标物质是基于以前的研究发现，满足多方面的考虑和需求。但由于药材化学成分的复杂性，难以对药材所有的成分进行测定，即使采用指纹图谱，也只是反映部分成分的含量，所以未来研究者们还应该关注与质量相关的药效物质基础研究，明确它们作用于人体的药效物质或有效成分群，探索更加科学合理的质量控制方法，有效地开展质量标准研究。

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附：2.炒山楂样品信息表

3. 设计方案和技术路线

一 研究方案

查阅文献资料,了解山楂主要指标性成分及含量测定方法。

1. 采用HPLC等度洗脱法,对山楂药材中枸橼酸进行含量测定。

4. 工作计划

2022年1月4日2022年1月29日

查阅文献，了解山楂的现行质量标准，山楂的主要化学组成、药理作用、治疗作用、临床的用法，收集样品、购买试剂，作好实验准备。

2022年2月10日2022年2月28日

5. 难点与创新点

2015版《中国药典》中炒山楂的含量测定方法为酸碱滴定法，测定方法简单易行，测定的成分是酸的总量。

而本课题采用以十八烷基键合硅胶为充填剂，采用高效液相色谱法，测定山楂中枸橼酸成分，该方法精密度高，分离性好，重复性强，用于山楂的质量检验，高效液相色谱法现在已经普及，基层一线比较容易实现，为山楂的质量控制提供重要的参考，为药监部门对山楂进行质量监控提供参考方法，为2020版《中国药典》山楂质量标准的修订提供参考依据。

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