1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
{title}文 献 综 述1.1 前言石油作为一种重要的战略资源，从它出现至今约一个半世纪的时间里，深深影响并且改变了整个世界。
对于石油的追求，直接影响到了世界各国的政治、经济、外交和军事政策[1]。
从航空航天再到我们身上穿的衣服裤子，到处离不开石油的影子。
随着经济发展，原油的使用早已成为了社会发展的重要一环。
石油采油技术按照技术原理以及采油阶段大致可分为：一次采油技术，即石油开采初期，由于地层的压力使得原油自喷，这种依靠天然能量进行油田开采就是一次采油。
不单是地层压力，一次采油技术还包括天然水驱，弹性能量驱，气驱以及重力驱等等。
二次采油技术，与一次采油技术不同的是其在注水范围上进行了较大扩展，利用了注水作业和相关的物理化学方法来提高石油的采收率。
但在二次采油的后期阶段，原油采收率依旧会出现下降，这就需要我们使用其他方法来进一步开采油藏，化学手段的引进使得采油技术大放异彩，即三次采油技术。
三次采油技术主要用到活性剂及聚合物等来改变液体的物性从而使得原油采收率提高，其中聚合物驱应用最广，效果也最明显[2]。
1.2 微生物采油技术介绍微生物采油技术（MEOR）是目前国内外发展迅速的一种石油开采技术，这种技术基于三次开采技术并在原有技术基础上进行了创新，从而实现了对原有油田的进一步开采，对油藏中没有采集到的残油部分进行了有效回收[3]。
在传统的三次开采中，之所以会消耗大量的资源，主要在于轻质油的回收。
通过利用微生物来处理石油液体的相变，提高石油的流动性，便于进一步开采。
不仅如此，微生物还能够在新陈代谢过程中，消耗大量的废物，产生热量和二氧化碳，在一定程度上提高了石油表面的活性。
微生物采油技术通过利用细菌对地层的直接作用，或其产生的各种代谢物来提高石油的开采效率。
由于微生物的使用，使得地表下不流动的原油也能够利用起来，并且能够延长枯竭油井的生产寿命。
开采过程中，细菌的直接作用主要体现在以下两方面：一是微生物在岩石表面的进行繁殖，在一定程度上能够驱出原油；二是降低原油的粘度，提高了原油的流动性，从而提高石油的开采效率[4,5]。
1.2.1 微生物提高采油技术的原理主要包括以下几方面1) 微生物在油层增殖，形成生物量。
菌体通常粘附在岩石表面，改变岩石表面的润湿性，从而将岩石上附着的油膜排代下来。
2) 微生物在地下发酵过程中产生了各种气体，如甲烷、二氧化碳、氮气、氢气等，这些气体可以增加油层的压力，降低原油粘度。
3) 微生物在地下发酵过程中产生了生物聚合物，这些生物聚合物调整了注水油层的吸水剖面，控制了高渗地带的流度比，改善地层的渗透率。
4) 能够降解烃类的微生物可以将高分子的石油烃类降解为低分子的烃类，从而降低石油的粘度以及凝点，增加原油的流动性。
5) 微生物在地下发酵过程中产生了生物表面活性剂，它能够降低水-岩石-原油体系的界面张力，提高洗油效率。
表面活性剂除了可以降低油水界面张力和乳化原油以外，还能通过改变油层岩石界面的润湿性来改变岩石对原油的相对渗透性，有些表面活性剂还能降低重油的粘度。
所有的这些作用都有利于提高石油采收率[6,7]。
1.2.2 微生物采油技术的优缺点优点:在石油开采过程中采用微生物采油技术能够有效地保护环境，降低对环境的污染，同时也可以提高石油的开采效率，这种开采技术在实际的开采中被广泛推广。
不仅如此，这种石油开采技术还能够在一定程度上节省开支，减少成本，对于提高企业经营效益具有重要作用。
对于其他一些开采技术，这种技术还可以有效地降低工作人员的工作量，节约人力资源，提高开采效率。
缺点:虽然微生物采油技术在实际的开采过程中被广泛推广，但是这种开采技术在实际的应用中容易受到周围环境因素的影响，这也是这种开采技术的最大缺陷。
当温度较低时，微生物的活动也会随着减弱，这就会在很大程度上降低开采效率，使采油量大大折扣。
在冬季采油时，如果没有制定应急方案，这就会使采油量很大程度上降低，给企业带来巨大的损失。
而且在微生物新陈代谢的过程中也会产生一些杂质，随着这些杂质的累积，也会对石油的开采带来阻碍，从而影响石油的开采量[6,8]。
1.3 生物乳化剂生物乳化剂是由微生物所分泌的高分子量聚合物，它不仅拥有传统乳化剂的各种性能，还拥有适用范围广，生物毒性低，对环境友好，可生物降解等诸多优点。
生物乳化剂是由多糖、脂多糖、脂蛋白和蛋白质等组成的两亲复合物。
与其他通过化学合成或石油炼制法生产的表面活性剂相比，还具有无毒、可生物降解、生态安全以及高表面活性等优点，在石油领域具有广阔的应用前景。
常见的生物乳化剂可以分为多糖类、蛋白质类、脂多糖类、糖蛋白类、糖脂蛋白类[9,10]。
1.3.1 典型的生物乳化剂Emulsan（多糖）是由醋酸钙不动杆菌RAG-1代谢产生的胞外脂多糖，它虽然不能显著降低油-水的界面张力，但是它分布在油滴的表面，能够有效地阻止它们的聚并，使O/W（水包油）型乳状液稳定，从而有助于它在石油工业上的应用[11]。
抗辐射不动杆菌KA53的生物乳化剂被称为Alasan ，是一种由多糖和三种蛋白质(AlnA， AlnB和AlnC )组成的高分子量复合物。
Alasan稳定了各种水包油乳液，包括链长为10或10以上的正构烷烃、烷基芳烃、液体石蜡、大豆和椰子油以及原油。
初步的化学表征表明，Alasan是一种阴离子、高分子量、不含丙氨酸的杂多糖和蛋白质的复合物[12,13]。
1.3.2 生物乳化剂的有效成分Emulsan与Alasan是目前研究最深入的两种生物乳化剂。
Emulsan的主要有效成分是糖脂，它需要由一种酯酶的介导才能从细胞表面释放。
Gil Walzer等人发现 Emulsan培养初期形成的小包囊在细胞表面积累，当细胞到达饱和时，会有酯酶介导小包囊让其从细胞表面释放成为有活性的乳化剂进人培养基中，如果除去细胞表面的酯酶，那么细胞就不能释Emulsan。
所以，酯酶的有无与Emulsan产生是密切相关的；放射抗性不动杆菌KA53 (Alasan)的生物乳化剂是一种大量的蛋白质和多糖复合物。
这种复合物的主要乳化活性与与外膜蛋白OmpA同源的45 kDa蛋白(AlnA)有关。
AlnA的乳化能力取决于跨膜结构域的四个环中是否存在疏水残基[14,15]。
1.4 生物乳化剂的应用1.4.1 在石油工业上的应用1.4.1.1 在MEOR中的应用生物乳化剂的应用最早最广泛的就是在石油工业上。
就提高原油采收率而言加入生物乳化剂可以降低油水界面的界面张力使原油具有较强的乳化、降粘效果，同时可以增加含油岩石的润湿角使得岩石孔隙中的残余油从中脱附出来，以此来提高原油采收率，因此生物乳化剂在三次采油方面应用广泛[5,6,16]。
1.4.1.2 在原油清洗中的应用生物乳化剂在清除原油中的沥青质和石蜡上也有广泛应用。
沥青质和石蜡在油井和输油管道中沉积会给原油的开采带来很大困难。
采用生物乳化剂可以解决很多不必要的支出，减少成本的支出[17]。
1.4.1.3 在原油回收中的应用生物乳化剂还可以用于处理原油罐中原油的回收。
例如：Emulsan 具有的牢固附着在O/W界面的特性，使用很少的Emulsan就可以使O/W (水包油)型乳状液稳定，所以可用于油罐中污泥的清洗和清洗后原油的回收等方面[11,18]。
1.4.2 在环境方面的应用近年来由于对环境的重视，生物乳化剂在环境方面应用也日渐增多。
例如：在农业方面可以使用生物乳化剂来进行堆肥、土壤中的有机农药去除或者用作杀虫剂等等[19,20]。
1.4.3 在日用化学品中的应用随着生活水平的提高，人们对日常生活中的化学品的要求也越加苛刻。
生物乳化剂由于具有低毒性、抗菌性、皮肤的保湿能力以及与皮肤的亲和性好等诸多优点在护理产品中发展迅速。
例如：在用作皮肤保湿剂方面，磷脂类生物乳化剂具有提高化妆品的分散性、保持皮肤的湿润、活化皮肤的呼吸调整、皮肤的酸度等作用[21,22]。
1.4.4 在食品中的应用生物乳化剂可用于食品原料的加工，还可以用在面包和肉类生产上的改善面粉的流变学特性以及部分裂解的脂肪组织的乳化。
磷脂是最常用的乳化剂和稳定剂在食品中一般用在糖果、牛奶、面包糕点、仿奶制品、饮料及肉禽加工食品等方面。
除磷脂外蔗糖脂、卵磷脂等都是食品工业经常使用的乳化剂。
[23,24]。
1.5 本论文的研究内容和意义尽管生物乳化剂有着潜在的优势，但产量低和纯化成本高等一些问题也阻碍了生物乳化剂的实际应用。
为了解决这些问题，许多研究人员努力生产和开发更有效的生物乳化剂。
大量的研究表面，蛋白质在生物乳化剂的乳化活性中起着不可或缺的作用，而多糖在乳化系统中起稳定剂的作用。
基于这一前提，可以通过蛋白质和多糖成分的适当组合来获得设计的生物乳化剂，潜在地为特定的疏水化合物提供定制的生物乳化剂。
此外，由于生物乳化剂的蛋白质和多糖组分更容易在单独的工业加工中大规模生产和提取，因此可以以相对较低的成本提供这些组合的生物乳化剂。
本实验室开发了具有乳化活性的乙酰木聚糖酯酶AXE及SDR家族氧化还原酶E26，本研究评价了两种蛋白生物乳化剂在微生物提高采油技术MEOR中的应用，并将两种蛋白与不同多糖组合，进一步降低其应用成本[25]。
参考文献[1] 马宏,孙竹.建立我国战略石油储备的政治思考[J].战略与管理,1997 :46-51.[2] 李宇慧. 石油采油技术的发展与应用[J]. 中国石油和化工标准与质量, 2018, v.38；No.472(14):161-161.[3] 秦芳玲,樊月,白海涛.微生物采油技术的研究进展[J].现代化工,2016(1):49-52.[4] 刘小明. 我国微生物采油技术现状及发展前景探析[J]. 中国石油石化, 2016, 23(No.358):93-94.[5] 赖枫鹏, 岑芳, 黄志文,等. 微生物采油技术发展概述[J]. 资源与产业, 2006(02):60-62.[6] 李功强,李丽.微生物提高石油采收率技术探讨[J].石油地质与工程,2006(6):75-77.[7] 王岚. 微生物采油及其作用机理[J]. 世界地质, 2002.[8] 潘未, 汪洋. 分析微生物采油技术的发展现状[J]. 中小企业管理与科技(中旬刊), 2014, 04:324-325.[9] 范立梅. 生物表面活性剂及其应用[J]. 生物学通报, 2000, 08:24-25.[10] 李敬龙,刘晔,潘爱珍.生物表面活性剂及其应用[J].山东轻工业学院学报：自然科学版,2004(2):41-46.[11] 罗强,蒲万芬,滕小兰, 等.高分子生物表面活性剂Emulsan的研究进展[J].日用化学工业,2008,38(3):185-188.[12] Bekerman R , Segal G , Ron E Z , et al. The AlnB protein of the bioemulsan alasan is a peroxiredoxin[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(5):536-541.[13] Navon-Venezia S , Zosim Z , Gottlieb A , et al. Alasan, a new bioemulsifier from Acinetobacter radioresistens.[J]. Appl.environ.microbiol, 1995, 61(9):3240.[14] Walzer G , Rosenberg E , Ron E Z . The Acinetobacter outer membrane protein A (OmpA) is a secreted emulsifier[J]. Environmental Microbiology, 2010, 8(6):1026-1032.[15] Toren A , Navon-Venezia S , Ron E Z , et al. Emulsifying Activities of Purified Alasan Proteins from Acinetobacter radioresistens KA53[J]. Applied g离心10 min收集细胞。
将细胞重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 7.4，经高压匀浆机进行高压破碎细胞，破碎后10000g离心20 min，弃沉淀取上清液，即为粗酶液。
2) 蛋白量的测定：使用Brandford法测定蛋白量。
蛋白标曲的制作：配制考马斯亮蓝溶液：100 mg 考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95% 乙醇中，再加入100 mL 85%（v/v）H3PO4，最后用蒸馏水稀释至1 l，滤纸过滤后可使用；配制0.1 g/L BSA：称取0.01g BSA，溶于10 mL蒸馏水中，使用前用生理盐水配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 mg/mL；取7个2 mL离心管，编好号（0，1，2，3，4，5，6），在1~6号离心管中分别加入上述稀释后各浓度BSA溶液0.3 mL，最后在每支离心管中加入1.2 mL 考马斯亮蓝溶液。
在0号离心管中1.2 mL 考马斯亮蓝溶液和0.3 mL生理盐水。
各管混合后，以0号管为对照测定A595，测得的标准曲线。
蛋白的检测具体步骤如下：首先以牛血清蛋白（BSA）标样的浓度对OD595吸光值作标准曲线方程。
然后适当稀释的酶液300 μL ，加入1.2 mL考马斯亮蓝工作液，混匀，室温放置15 min，与595 nm下测定吸光值。
每组做两个平行样，以蒸馏水为空白。
3) 粗酶液的纯化：缓冲液A（结合液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 7.4；缓冲液B（洗脱液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，500 mM咪唑，pH 7.4。
采用Ni-NTA HisTrap FF柱子进行蛋白纯化：将粗酶液的上清用0.22 μm微孔膜过滤后备用；将柱子安装于蛋白纯化仪上，用10倍体积的结合液平衡镍柱，设流速为1.0 mL/min；待平衡后上样进行蛋白挂柱；用5倍体积的结合液冲洗镍柱，将未与镍柱结合的蛋白洗去；再用洗脱液进行洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液；透析过夜出去其中的咪唑，然后用10 KDa的超滤管离心进行蛋白浓缩，并用SDS-PAGE分析纯度（图1）。
SDR家族氧化还原酶E26的获取1) SDR家族氧化还原酶E26的培养：培养基：LB培养基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L。
培养条件：250 mL锥形瓶中装液量50 mL，培养温度37℃，200 rpm，培养至OD600达到0.6-0.8时，加入1 mM IPTG诱导SDR家族氧化还原酶E26的表达。
28℃，200 rpm培养12时后，10000g离心10 min收集细胞。
将细胞重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 7.4，经高压匀浆机进行高压破碎细胞，破碎后10000g离心20 min，弃沉淀取上清液，即为粗酶液。
2) 蛋白量的测定：使用Brandford法测定蛋白量。
蛋白标曲的制作：配制考马斯亮蓝溶液：100 mg 考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95% 乙醇中，再加入100 mL 85%（v/v）H3PO4，最后用蒸馏水稀释至1 l，滤纸过滤后可使用；配制0.1 g/L BSA：称取0.01g BSA，溶于10 mL蒸馏水中，使用前用生理盐水配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 mg/mL；取7个2 mL离心管，编好号（0，1，2，3，4，5，6），在1~6号离心管中分别加入上述稀释后各浓度BSA溶液0.3 mL，最后在每支离心管中加入1.2 mL 考马斯亮蓝溶液。
在0号离心管中1.2 mL 考马斯亮蓝溶液和0.3 mL生理盐水。
各管混合后，以0号管为对照测定A595，测得的标准曲线。
蛋白的检测具体步骤如下：首先以牛血清蛋白（BSA）标样的浓度对OD595吸光值作标准曲线方程。
然后适当稀释的酶液300 μL ，加入1.2 mL考马斯亮蓝工作液，混匀，室温放置15 min，与595 nm下测定吸光值。
每组做两个平行样，以蒸馏水为空白。
3) 粗酶液的纯化：缓冲液A（结合液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 7.4；缓冲液B（洗脱液）：100 mM磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，500 mM咪唑，pH 7.4。
采用Ni-NTA HisTrap FF柱子进行蛋白纯化：将粗酶液的上清用0.22 μm微孔膜过滤后备用；将柱子安装于蛋白纯化仪上，用10倍体积的结合液平衡镍柱，设流速为1.0 mL/min；待平衡后上样进行蛋白挂柱；用5倍体积的结合液冲洗镍柱，将未与镍柱结合的蛋白洗去；再用洗脱液进行洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液；透析过夜出去其中的咪唑，然后用10 KDa的超滤管离心进行蛋白浓缩，并用SDS-PAGE分析纯度。
2.2.3 AXE、E26蛋白的评价2.2.3.1 表面张力发酵液表面张力的测定采用白金板法，以蒸馏水和空白发酵液作为对照。
取 30 mL 发酵液上清液（10000g，离心 20 min）置于洁净的称量皿中，重复三次测得表面张力值并取平均值。
2.2.3.2 乳化活性以柴油为底物测定乳化活性，2 mL发酵液上清和2 mL柴油混合于玻璃小瓶中，漩涡震荡1 min后静置24 h,测定其乳化活性。
采用乳化指数EI24计算乳化活性，公式如下:乳化指数El24=乳化层高度/有机相层高度100%2.2.3.3 乳化稳定性在不同 pH 值、温度和盐浓度条件下考察了生物乳化剂的稳定性。
在热稳定性试验中，将生物乳化剂溶液(1 g/L)在 60-95oC 的水浴锅中加热 1 h 后，测定其的乳化指数；考察了生物乳化剂在 10-300 mM 的 NaCl、MgSO4、CaCl2 盐浓度下的稳定性；以及不同 pH 条件下(pH 3-11)生物乳化剂的稳定性。
以上实验均使用浓度为 1 g/L 的生物乳化剂，缓冲液使用50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4，以柴油为有机相底物，按照乳化活性的方法测定乳化指数以考察 SL-bioemulsifier 的稳定性。
2.2.3.4 润湿性用微量进样器从距玻璃片1cm高度缓慢滴下50μL溶液，待润湿，平衡后，表明该周边三相界面的自由能（以界面张力表示）已达到平衡。
在此条件下，在润湿周边上任意一点处，液-气界面的切线与固-液界面切线之间的夹角称为接触角，用θ表示 。
当固-液-气三相界面张力平衡时，润湿的基本方程如下，亦称润湿方程。
式中：cosθ为界面接触角；σs-g为固-气接触面；σs-l为固-液接触面；σl-g为液-气接触面；该公式表明平衡接触角θ是三相界面自由能(表面张力)的函数，它不仅与固体表面性质有关，也与气-液界面的性质有关。
cosθ称为固体表面的润湿性，通过测定接触角，可以对固体的润湿性和可浮性作出大致的评价。
接触角最小为0，最大为180。
接触角越小，则固体的润湿性越好。
θ= 0，液体完全润湿固体表面，液体在固体表面铺展；0 < 180，液体不能润湿固体；="" θ="180，完全不润湿，液体在固体表面凝聚成小球。
" 2.2.3.5="" 起泡性="" 将e26、e59分别与柴油配成不同浓度的溶液，测量起泡效果，然后列出表格分析起泡性能。
="" 2.2.3.6="" 降黏性="" 将e26、e59分别与原油配成不同浓度的溶液，在粘度计下测量，然后列出表格分析降粘性。
="" 2.2.4="" axe、e26蛋白与不同多糖复配="" 将纯化后的sdr家族氧化还原酶e26与axe分别配成100="" mg/l、200="" mg/l（50mm="" tris-hcl="" ph="" 7.4）的溶液，并加入终浓度为1="" g/l的不同糖类（果糖、蔗糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻糖、淀粉、明胶、黄原胶、阿拉伯树胶），与柴油进行乳化反应，漩涡震荡2分钟，在室温下静置48="" h后，计算其乳化活性。
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