1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒强毒引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病，俗称“亚洲鸡瘟”[1]。在我国，ND被农业部规定为一类动物疫病。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）为副粘病毒科禽腮腺炎病毒属中的一员，属于禽副粘病毒1型[2]。在NDV基因组上依次排列着NP、P、M、F、HN和L基因，分别编码核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素—神经氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L）。尽管NDV存在多个基因型，但只有一个血清型。强毒株和弱毒株的主要差异是在F0蛋白的112-117位氨基酸基序即裂解位点上。
P基因约1.4kb，编码395个氨基酸，分子量约为42KD，病毒粒子中含量较少[3]。它具有病毒特异性，目前为止研究的较少，其蛋白的确切作用尚未清楚。P基因除了可以转录翻译P蛋白外，还可以通过转录修饰表达另外两种蛋白，为V蛋白和W蛋白。研究表明，新城疫病毒在感染细胞的早起会编码出早起蛋白（NP、P蛋白），NP、P、L蛋白结合形成核糖核蛋白复合体（RNP）后，开始其他翻译晚期蛋白F、HN及M蛋白等[4]。其中，P蛋白可以与前体NP蛋白作用，形成P-NP复合体，阻止NP蛋白与病毒核酸的组装，此外，P蛋白还可以延长基因表达的能力。可见，P蛋白在病毒感染细胞初期有着重要作用。
本实验对新城疫病毒的磷蛋白（Phosphate Protein ，P蛋白）基因片段，进行引物设计和PCR扩增，并且重组进带His标签的pCold I表达载体中，之后分别转化入克隆宿主菌E.coli DH5α和表达宿主菌E.coli BL21中。然后，对菌液进行PCR鉴定，分析P基因是否成功连接在pCold I载体上及转化入了工程菌中。利用IPTG对表达表达宿主菌E.coli BL21进行诱导表达，收集并裂解细菌，对裂解上清液和裂解细菌沉淀及时分开并对重组蛋白的可溶性进行分。鉴定完NDV-P蛋白的表达形式以后，扩大菌株的培养规模，对NDV-P蛋白进行大量表达。利用镍离子琼脂糖珠与6个连续排列组氨酸（6xHis）标签的亲和作用，对表达产物进行蛋白纯化[5,6]。最后，对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot实验鉴定，分析产物大小是否与预期一致，以及重组蛋白是否与鸡新城疫的阳性血清具有良好的免疫反应性。
2. 研究的基本内容和问题
目标：成功克隆NDV的P基因，并实现其在原核表达系统中的高效表达，为以后的新城疫病毒疫苗、新型诊断试剂的研制等奠定基础。
内容：对新城疫病毒的磷蛋白（Phosphate Protein P）基因片段进行克隆，将P基因重组进带His标签的pCold I表达载体中，之后分别转化入克隆宿主菌E.coli DH5α和表达宿主菌E.coli BL21中。对重组转化均成功的BL21工程菌进行原核表达及鉴定，摸索最佳的诱导表达条件，之后大规模诱导表达并纯化产物。
关键问题：1、设计引物，特异性的扩增出NDV-P片段，并将这段基因重组转化进大肠杆菌，构建出可以表达NDV-P蛋白的载体。2、对于表达的蛋白尽可能的提高纯化纯度，之后对其特异性、敏感性等进行分析。
3. 研究的方法与方案
方法：运用分子生物学和微生物学实验知识，通过鸡胚接种，对病毒进行扩繁。之后，对目的片段进行扩增，重组DNA技术，构建出表达NDV-P的载体，表达目的蛋白，并进行免疫学分析鉴定等。
1 实验材料的准备
表达载体 pET-32a( )、pCold、pGEX-4T-1-IBV-nsp5 以及克隆宿主菌 E.coli DH5α、表达宿主菌 E.coli BL21 及 NDV-Lasota 疫苗毒株、AIV 毒株均由本实验室保存。Trizol购自上海普飞生物技术有限公司；反转录试剂盒购自 Fermentas 公司；限制性内切酶EcoR I、Sac I、Hind Ш 从 Takara 公司购买；凝胶回收试剂盒从 Axygen 公司购买，质粒抽提试剂盒从 Qiagen 公司购买；Ni 填料购自 QIAGEN；羊抗鼠 IgG-HRP 标记二抗，KPL 公司。
4. 研究创新点
用国内常用的新城疫LaSota疫苗株，进行P基因的克隆，从过去对HN、F基因的热衷研究，转到其他基因，本实验为P基因的生物学功能研究做好前期准备。
5. 研究计划与进展
2018年9月查找资料
2018年10月对目的基因进行扩增
2018年11月构建表达NDV-P蛋白的载体
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