1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一.研究意义
猪增生性肠炎（pcine proliferative enteritis，PPE），是由胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis，Lintracellularis）感染所致的一种发生于断乳仔猪的接触性肠道疾病。由于该病的死亡率不高，导致相关从业人员缺乏重视，但其引起的猪的营养不良和生长抑制使我国养猪业遭受了严重的经济损失。目前国内很多猪场对该病的感染情况不够重视，且对该病的检测技术还尚不成熟，很多方法都存在不足。本实验拟通过针对胞内劳森菌特异性基因片段设计PCR检测方法，对从南京某猪场采集的猪的回肠样品和粪便样品进行PCR检测，进而分析该猪场胞内劳森菌的感染情况。
胞内劳森菌，分类上属于劳森菌属，革兰氏阴性菌，抗酸染色阳性，可以被镀银法着色，也可以被Modified Ziehl-Neelsen染色法染成红色。具有三层外膜，形态不一，多为弯曲形，也有S形、逗点形和直形等形态，无纤毛和孢子，但该菌在胞外时具有一根极性鞭毛[1]。该菌为严格的胞内寄生菌，不能通过普通培养基和鸡胚培养，只能在一定的条件下通过细胞培养获得，合适的细胞系主要有IEC-18、IPEC-J2和IGPC-1651等，微需氧。对季铵盐类消毒剂和含碘消毒剂敏感[2]。
当胞内劳森菌通过消化道感染后，早期在肠上皮黏膜细胞的胞质中大量增殖，使肠壁上皮细胞一直处于有丝分裂状态，肠壁组织高度增生，使其失去了成熟细胞该有的功能，并且吸收营养能力大大降低，使感染猪饲料利用率下降，生长受到抑制。并且随着机体的代偿和修复，使病变重叠发生，导致肠壁细胞的大量脱落，引起顽固性腹泻和血痢，随着肠壁表面纤维化的不断加重，可能导致肠壁破裂引起突然死亡[1]。病变主要见于回肠后端、盲肠和结肠前端，最常见于临近回盲瓣的回肠末端。小肠套叠，高度水肿。切开肠壁，可见肠壁增厚变硬，覆盖有灰黄色的纤维素性渗出，肠腔充血出血。急性病例还可见肠壁上有溃疡形成。组织病理学最主要的特征是可见回肠和结肠隐窝内未成熟的细胞发生腺瘤样增生。在油镜或电镜下可在细胞周围和胞内看见弯曲的杆状细菌。
PPE的宿主广泛。在猪场中，主要传染源是病猪和带菌猪，潜伏期一般为2-3周，感染猪在7天开始排毒，并于28天达到高峰[3]。夏秋季多发，冬春季较少发病，病菌可以通过肠道进入粪便中，在粪便中最多可以存活10周，粪口传播是该病的主要传播途径[1]。所有日龄的断乳仔猪均易感。外界环境的改变与本病息息相关，温度过高、过低或温差过大都易导致该病的发生。应激的出现也可引起该病的发生，如长途运输、密集的免疫接种和饲料的突然改变等。另外，胞内劳森菌可长期寄生于鼠类肠道内，鼠类在猪场中也是一个重要的传染源[4]。根据全球流行病学调查，该病难以控制，目前已呈全球性流行，近年来在亚洲地区呈上升趋势，是当今规模化猪场难以控制的三大疾病之一[5]。2-20周龄的断乳仔猪都易感[2]，其中生长育肥猪、后备母猪最为易感，严重影响了我国养猪行业的经济效益，每头患有PPE的猪都将导致猪场产生1.531美元的损失[6]。
2. 研究的基本内容和问题
四.研究的目标和内容本实验拟通过针对胞内劳森菌特异性基因片段设计PCR检测方法，对从南京某猪场采集的猪的回肠样品和粪便样品进行PCR检测，进而分析该猪场胞内劳森菌的感染情况。
在实验前期，主要是查阅Li的相关文献报道，并从南京周边猪场或者屠宰场中尽可能多的采集到猪的回肠和粪便样品，以备后期进行Li的PCR检测用。实验中期，主要是找到Li的特异性基因片段并合成引物、探究如何处理猪回肠和粪便样品、探究如何从样品中提取Li的DNA以及不断优化PCR反应体系和条件。
五.拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
六.研究方法、技术路线和实验方案本次实验前期需要通过相关文献的查找，找出Li的特异性基因片段，以备后期PCR检测；然后去猪场或者屠宰场进行猪回肠和粪便样品的采集，并在实验室内摸索最佳的样品处理方法；之后打算通过购买的组织和粪便DNA提取试剂盒对处理好的样品进行DNA提取；对提取出的DNA进行PCR检测，并针对PCR结果不断进行优化；最后建立好PCR检测方法后，对采集回来的样品进行大量检测，并根对该猪场劳森菌感染情况进行初步调查。
七.可行性分析
根据查找的文献，已经发现了一些Li的特异性基因片段，可用于后期PCR检测；并且由于PPE在国内的感染率在30-70左右，采集到阳性样品的概率很大；实验室内已经有两种DNA提取试剂盒，反馈的使用效果较好，提取出Li的DNA的可能性很大；另外，所在实验室常年从事细菌相关的研究，设备齐全，指导老师以及师兄师姐对于细菌的分离提取鉴定都有很资深的经验，完全有能力指导我进行实验。
4. 研究创新点
八.特色及创新之处目前国对于Li的研究并不多，对于Li的检测技术尚不成熟，本实验预期建立的PCR方法对于Li的检测可能具有一定的实用价值。由于Li存在于肠道组织和粪便中，其内容物、粘液、细菌以及杂质很多，如何正确处理肠道组织和粪便，是本实验的难点之一，一旦攻克，将对日后肠道细菌的分离提取提供宝贵的实际操作经验。由于PPE的致死性不高，国内很多猪场对PPE的感染情况并不了解，如果PCR检测方法建立成功，可以对南京周边猪场进行PPE流行病学分析，为其提供具有针对性的PPE防控指导。
5. 研究计划与进展
九.研究计划和预期进展
在实验前期，打算通过查阅相关文献，找到关于Li的特异性基因片段，以及查找一些关于肠道样品处理、DNA提取和PCR方法的优化的相关方面的文献，为接下来的实验打好理论基础。在实验中期，主要想要从猪场或屠宰场采集大量的回肠和粪便样品，并摸索出完善的处理方法、DNA提取方法和PCR体系条件。实验后期，在优化好PCR各种条件后，打算对采集的样品进行大量检测，对南京周边猪场的PPE感染情况进行简单的流行病学分析。
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