1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)是嗜血杆菌中的一种，为革兰氏阴性的条件性致病菌。该菌广泛存在于环境中，在健康的猪群中也能发现，常引起断奶前后仔猪以多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热等临床特征的传染性疾病。副猪嗜血杆菌病又称为格拉泽氏病(Glazer's Disease),是一种范噬性传染病，在集约化养猪场主要表现为多发性浆膜炎和关节炎，或呼吸道型的继发性支气管炎[1]。
血清学研究证明副猪嗜血杆菌菌群内具有高度抗原性差异，目前已知的血清型有15种。其中血清型1、4、5、10、12、13、14型会导致革拉泽氏病。美国、德国、加拿大、西班牙及日本等国的血清流行病学调查证明5型和13型为主要流行的血清型[2]。蔡绪旺等对我国的感染病例进行了调查研究，证明我国目前以血清型4型和5型最为流行[3]。一些分子生物学方法例如限制性核酸内切酶图谱法、双酶切电泳法、重复基因共有序列PCR、间接血凝试验等都可以用来进行Hps分型[4]。副猪嗜血杆菌的毒力因子目前并没有完全的定义。许多血清学流行调查和实验室结果表明，脂多糖、唾液酸酶和副猪嗜血杆菌产生的特定的毒素均与该菌的毒力有关。副猪嗜血杆菌病主要影响处于哺乳期的仔猪、生长育肥猪和4月龄以内的保育猪。由于HPs的母源抗体在4-6周龄时降低导致断奶以后的仔猪和保育阶段的猪，尤其5-8周龄的猪最易发病[5]。根据研究结果，副猪嗜血杆菌病的发病率可能是报道的10倍之多[6]。该病爆发后通常呈现并发感染或混合感染，发病率可达到100%，死亡率高达50%-90%，幸存猪常成为僵猪，生长发育迟缓，严重影响了仔猪和青年猪群体的健康，给我国的养猪业带来重大经济损失，因此做好副猪嗜血杆菌病的预防和控制工作十分重要[7]。
副猪嗜血杆菌的分离对于该病的确诊十分重要，但由于副猪嗜血杆菌的体外生长环境极为严苛、样本中常常混有其他菌株如巴氏杆菌、分离传代后的副猪嗜血杆菌不易存活、经过保藏后的菌株不易复苏、菌株存活率低等，导致临床上难以成功分离副猪嗜血杆菌，因此易造成副猪嗜血杆菌病的误诊或漏诊等。分离和长期保藏副猪嗜血杆菌菌种为日后的菌株性质鉴定、生理性质和生化性质研究以及培养特性研究和与其他菌种的鉴别提供了便利。因此试验过对两株菌种进行鉴定并保藏，评价保藏后Hps菌株的存活时间、存活率方面的保藏效果，为副猪嗜血杆菌的鉴定方法和病理研究等提供必要的基础。
2. 研究的基本内容和问题
将江苏省农业科学院兽医研究所分离并保存的副猪嗜血杆菌XX0306F4（批号20120110）和FS0307F9（批号20120110）冻干菌株在TSA培养基上增殖，收获菌体，分别进行的进行形态鉴定、染色镜检、PCR扩增、和血清学鉴定，血清型鉴定包括双向琼脂扩散试验和微量凝集试验。经过检测和鉴定的菌株加入冻干保护剂后放入真空机中，经过真空冷冻干燥制成粉末。冻干后的菌种每20d进行抽样复苏，检验纯粹性并通过检测细菌存活时间、存活率等评价保藏效果。
检测和鉴定目的菌株是否纯粹，确定其病原学特性和血清学特性，明确两个菌株的血清型，并在保藏后通过纯粹检验、存活时间、存活率等结果判断是否达到了较好的保藏效果。
3. 研究的方法与方案
（一）试验方法：
1.菌落形态观察：将副猪嗜血杆菌XX0306F4冻干菌株和FS0307F9冻干菌株及标准株接种含1%TSA的琼脂平板，置于37℃培养箱中培养18-28h，观察菌落的形态。
2.细菌形态观察：复苏后的平板上挑取单一菌落进行划线培养，生长后挑取单一的菌落制作涂片并进行革兰氏染色，在显微镜下观察两个菌株和标准菌株的细菌形态。
4. 研究创新点
本试验在鉴定方法上采用了传统的副猪嗜血杆菌鉴定方法。在细菌保藏的阶段，由于查阅和分析文献总结到一些细菌保藏方法例如普通斜面低温保藏、甘油生理盐水保藏等保藏方法的保藏效果不佳，随着保藏时间的延长，细菌的存活率和毒性均容易受到影响，且保藏的过程中受到外界污染的可能性较高，本试验采用了冻干机进行真空冷冻保藏的方法，最大程度地延长两个菌株的保藏时间和活力，并减小受到污染的可能性。
5. 研究计划与进展
计划在1个月-1.5个月内完成两个冻干菌株及标准菌株的复苏和鉴定工作，并整理数据，分析结果。鉴定的阶段试验完成后将2个菌株分别进行分装和冻干，并在冻干一周后开始随机抽样保藏效果评价的试验。从第一次试验开始，计划每20d进行一次抽样复苏并检测。
预计在60天内完成全部鉴定工作、保藏以及2次保藏效果评价试验。
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