1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种疱疹病毒，能够感染猪、牛、羊等家畜及野生动物，主要侵害神经系统及生殖系统，降低家畜的生产性能，甚至导致动物死亡。据不完全统计，全世界范围内己有44个国家和地区报道过伪狂犬病的发生。猪是PRV的天然宿主，各个阶段猪均可感染。新生仔猪感染后呈现神经症状，且死亡率极高；妊娠母猪、种公猪以繁殖障碍为主；生长育肥猪则表现为呼吸道症状。一旦猪群发生PRV感染，病毒很难被清除。猪伪狂犬病因传播速度快、范围广、途径多，以及病原顽固等特点，被定义为极难防疫的自然疫源性疾病，国际动物卫生组织（OIE）将其列为须报告动物疫病。目前，一些欧洲和北美国家通过积极有效的疾病防控手段和扑杀程序，已将PRV 彻底净化。但 PRV 在我国仍广泛流行，引起的经济损失巨大。
目前鉴别 PRV 感染的诊断方法主要有免疫荧光法、琼脂免疫扩散试验、PCR、ELISA 等。ELISA是目前应用较广泛的检测方法之一，具有灵敏、特异、微量、数字化、快捷、批量化及易于自动化操作等优点。该方法不仅适用于临床样品的检测，而且由于可以进行批量化的样品，也适用于血清流行病学调查。
参考文献：寇晓晶,高峰,郭慧琳,等.猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接 ELISA 抗体检测方法的建立[J]. 中国动物检疫，2018，35（5）：91-94.
2. 研究的基本内容和问题
随着我国养猪业的规模化、集约化的发展，伪狂犬病的发生和流行日益频繁，严重制约了我国养猪业的健康发展。基因缺失疫苗是在主要毒力基因胸腺激酶缺失的基础上将非必需糖蛋白基因进行缺失获得的双基因缺失疫苗，这样得到的弱毒突变株不能刺激动物产生抗缺失蛋白的抗体，但又不影响病毒在细胞上的增殖与免疫原性，从而通过血清学方法将自然感染野毒猪与疫苗免疫猪区分开来，达到防治、净化的目的。在大多数已启动伪狂犬病根除计划的国家中，主要采用基因缺失疫苗配合一鉴别诊断方法来根除此病。我国的猪伪狂犬病基因缺失疫苗己研制成功，但尚没有理想的一诊断试剂，因此开展与之配套的诊断方法的研究与应用，推行该病的根除计划亦势在必行。
但目前商业化应用的一试剂盒多采用细胞增殖病毒方式或者病毒系统表达蛋白制备抗原，这种方法的成本高，操作繁琐，还存在散毒的危险。大肠杆菌表达系统是人们应用最多，研究最为透彻的外源蛋白表达系统，大肠杆菌表达系统的主要优点是其遗传背景和生化特性清楚、易于操作、生长迅速、培养基成本低、易于制备等。因此对于一些非糖基化蛋白或只要求其抗原性的蛋白，大肠杆菌表达系统是一个极好的选择。目前许多诊断试剂用的抗原都是由大肠杆菌表达的。
本研究中，利用大肠杆菌表达系统成功表达了基因的主要抗原表位区。建立了鉴别伪狂犬野毒株与一疫苗株的一方法。实验结果表明，该方法可显著区分基因缺失疫苗注苗猪与自然感染猪，且成本低廉,操作简单。由于这种方法以表达的蛋白质为抗原包被微孔板或致敏乳胶,故绝无散毒危险，安全可靠，为我国伪狂犬病的流行病学调查和伪狂犬病根除计划的实施提供了有力的技术支持。
3. 研究的方法与方案
为建立猪伪狂犬病毒(PRV)gE抗体血清学检测方法，本研究利用利用纯化的gE蛋白和HRP标记单克隆抗体建立了阻断ELISA方法。
1.准备实验所需试剂、细胞及菌株；标准血清及样品
2.纯化重组表达蛋白
4. 研究创新点
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的多种家畜和野生动物以呼吸和神经系统疾病为主要症状的一种急性传染病。PRV属于疱疹病毒科、疱疹病毒亚科、猪疱疹病毒Ⅰ型。PRV的基因组由线性双链DNA分子组成，大小约为150 kb。
本研究以原核表达的 PRV gE 蛋白为包被抗原，通过建立并优化间接 ELISA 方法，研制出了PRV间接 ELISA抗体检测试剂盒。与美国IDEXX生产的标杆产品对比发现，该试剂盒的阳性符合率为 85.14%，阴性符合率为 95.71%，总体符合率为95.36%。批间和批内重复性试验表明，该试剂盒变异系数均小于10%，具有较好的重复性。该检测试剂盒为猪场PRV 野毒感染检测提供了技术支撑，可用于猪场PRV野毒感染的临床检测。
5. 研究计划与进展
研究计划：2018年9月至10月：1.准备实验所需试剂、细胞及菌株；标准血清及样品2.纯化重组表达蛋白
2018年11月：3.标记单克隆抗体的纯化及辣根过氧化物酶（HRP）
2018年11月至2019年1月：4.按照阻断ELISA步骤逐一筛选阻断ELISA最佳反应条件：筛选抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度、筛选抗原包被时间及温度、选择最佳封闭液与封闭时间、选择待检血清作用时间、选择酶标单抗工作浓度、选择酶标单抗作用时间。
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