1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献） 小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morboli virus)的小反刍兽疫病毒(Peste des petis ruminants virus, PPRV)[1]引起的一种主要感染小反刍兽如山羊和绵羊的具有高度传染性的动物病毒病[2]，是单股负链 RNA(ss RNA)病毒(Banyard et al.2010)。截止目前，PPR是世界动物卫生组织(OIE)列出的必须通报动物传染病（OIE.2016）,是我国农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》及《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类动物疫病[3]，截止目前没有感染人的报道。小反刍兽疫的主要临床症状包括急性高热、口腔黏膜弥漫性溃烂、眼鼻分泌物增多、肺炎和腹泻(Griffin et al.2009)。PPRV主要感染幼年绵羊和山羊，有高达 85%的感染率和死亡率，另外一些野生反刍动物也可能感染[4]。小反刍兽疫1942年首先在非洲的科特迪瓦发生[5]。中国的第一例 PPR 病例发现于 2007 年的西藏[6]，随后2008年及 2010 年在西藏地区呈散发状态[7]。自 2013 年，PPR 疫情在我国由西部向东南方向蔓延。从新疆到辽宁，从内蒙到广东和等多个省区均有PPR疫情出现[8]。小反刍兽疫疫情传播呈现速度快、跨度大、风险高的特点，给我国动物疫病防控工作带来了严重的威胁。 羊支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of sheep）是由多种支原体引起的山羊和绵羊的一种高度接触性传染病，其临床特征是高热、咳嗽，肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，多取急性或慢性经过，病死率很高，可给养羊业造成巨大损失。绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是其中的重要病原之一，于 1963 年首次由Mackay在英格兰从患病的绵羊体内分离得到，并由 Carmichael 等正式命名为MO[9]。MO 可同时引起绵羊和山羊的传染性胸膜肺炎，患病羊临床表现为气喘、咳嗽、发热、渐进性消瘦和肺脏间质增生性炎症，尤其易侵害 1 至 3 月龄羔羊。绵羊支原体肺炎发病率约为 25%，病死率约为30%[10]，现已呈全球性分布，但多流行于中东、东亚、澳洲等养羊业较为集中的国家[11]。在我国，自 1982 年胡景韶等首次分离到 MO以来[12]，多个省份也分离到该病原体。据兰州兽医研究所 2014～2015 年所做的国内部分地区羊支原体肺炎血清学调查及分析显示，内蒙古自治区、河北省、吉林省三个区域的 MO血清抗体阳性检出率最高，分别达到 76.8%，50%，21.99%[13]。绵羊肺炎支原体流行广泛，致病力强，对我国乃至世界养殖业均造成巨大危害。 病毒分离是检测PPRV等病原的常用方法，但其费时费力，对实验室安全要求很高，绵羊肺炎支原体在体外生长相对缓慢、营养要求较高、易出现污染。这给这两种病原的快速诊断带来困难。PCR方法与之相比更加简便快速敏感，适合实验室的病原学诊断。MO在全球范围内均有分布, PPRV自2014年传入国内多数省区后危害巨大，二者均为引起山羊呼吸道疫病的主要病原，临床上存在混合感染，正确的诊断有助于疾病的防控。目前国内外针对绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒，均分别建立了特异的PCR或RT-PCR方法，并在这两种病原的检测、鉴定及流行病学调查方面得到了广泛的应用［14，15］，但是，同时检测MO和PPRV的RT-PCR方法尚未有报道。
参考文献： [1]王凤阳, 范泉水, 译. 兽医微生物学[M]. 北京:科学出版社, 2007 [2]韩红, 王莉莉, 唐伟静, 等. 小反刍兽疫病毒的研究进展[J]. 畜禽业, 2016(2):4-6
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2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容和拟解决的关键问题
研究目标：
设计绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒的引物对，建立特定双重PT-PCR方法，并对该方法进行优化，达到最佳检测条件，同时检测临床样品，确定其可行性和准确性。
3. 研究的方法与方案
研究方法及实验方案：
（1）引物设计与筛选：参考GenBank登录的绵羊肺炎支原体和小反刍兽疫病毒基因序列，利用MPprimer软件设计引物对，然后使用多因素引物特异性评估系统MFEprimer对所有引物组合进行严格的特异性评估，最终选择未发现存在非特异性扩增的引物对组合引物对；
（2）标准质粒构建：分别提取绵羊肺炎支原体DNA和小反刍兽疫病毒RNA；以绵羊肺炎支原体DNA为模板，进行PCR扩增，同时以小反刍兽疫病毒RNA为模板进行RT-PCR扩增，接着琼脂凝胶电泳，对产物进行回收纯化；
4. 研究创新点
支原体肺炎和小反刍兽疫一直是危害羊健康和养殖业经济的重要呼吸道疾病，目前临床上仅有单独检测MO和PPRV的RT-PCR方法，但是，同时检测MO和PPRV的RT-PCR方法尚未报道。该双重RT-PCR研究方法思路新颖、操作简单，能单独或/和同时检测MO和PPRV的感染，可以快速方便诊断，节约时间与成本，对实际生产养殖有重要意义。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2018年8月：查阅资料，学习理论知识；
2018年9月-10月：设计筛选引物，提取核酸，构建标准质粒载体；
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