1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪圆环病毒（PCV）是圆环病毒科圆环病毒属［1］，无囊膜包裹的单股环状负链DNA 病毒。PCV根据血清型可以被分为PCV1、PCV2和PCV3三种［2］。其中PCV1没有明确的致病性，PCV3与猪的繁殖障碍有关，PCV2则能够引起包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤等在内的多种疾病［3］。在临床以及实际生产中，因PCV2 具有免疫抑制特性， 从而使感染猪不能对其他疫苗或病原体产生有效的免疫应答，对其他疾病的易感性增强， 易诱发混合感染， 导致症状更为复杂，相对于PCV其他的两种血清型而言影响更大，造成的经济损失更严重。PCV2在我国多省市和地区都有过该病毒引起相关疾病的报道[a3]［4］。因此，对PCV2的进一步研究，有助于一线工作者们能够在生产实践中提高猪的健康率和存活率，减少不必要的经济损失。
现阶段PCV2感染的相关疾病防治中，疫苗免疫是最为主要而有效的防治措施。针对猪圆环病毒，国内外的研究重心目前主要是实验室诊断技术和疫苗研制。诊断技术方面常用的有病毒分离与鉴定、荧光定量PCR、ELISA等技术手段。而疫苗研制方面，国内外PCV2的商品化疫苗主要有3类：全病毒灭活疫苗、重组毒灭活疫苗和亚单位疫苗［5］。PCV2全病毒灭活疫苗因为具有安全、易生产、遗传稳定和无需冷冻等优点而被广泛应用。但全病毒灭活疫苗存在一个较大的问题：病毒滴度较低［6］。全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗虽然在防控PCV2方面起到一定作用，但不能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，细胞免疫相对比较弱，不能将猪群体内的病毒完全清除［7］。为了解决这个问题，人们进一步研究发现，病毒抗原含量对免疫效果影响较大［8］。因此，兽医界试图把PCV2适应于体外细胞的培养，经组织培养病毒增殖到较高毒价后制备成疫苗以用于预防猪圆环病毒病［9］。因此，PCV2的体外培养，一方面是为PCV2毒株的生物学特性及免疫原性研究提供基础条件；另一方面也为PCV2疫苗候选毒株的筛选奠定基础.
由于PCV2 是一种单链环状 DNA 病毒，因此它很容易产生一些基因变异，并且由于个体可以同时感染 PCV 的多种基因型毒株，因此不同基因型毒株之间可发生基因重组[10]。此外国内通常使用广泛而频繁的疫苗接种来预防疾病，从而产生了较强的疫苗免疫诱导选择压力，这些原因综合起来导致PCV2易突变产生多个亚型。目前PCV2基因组主要分为4个亚型（PCV2a～PCV2d）[11]。根据各地的报道以及对毒株基因序列的分析和整理，，国内外提出PCV2d 毒株大量存在并流行于采取了免疫措施后的猪场［12-15］，同时PCV2d在中国的有些地区已经逐渐有了成为主要流行病毒株的趋势[16]。因此，对于PCV2d的进一步了解以及相应毒株的培养显得必要而有意义。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
培育出能够在PK15细胞上稳定传代，并且病毒滴度较高的PCV2d毒株。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
本课题涉及到的研究方法有：细胞培养、病毒接种、病毒培养、病毒DNA提取、PCR检测、荧光定量PCR检测、PCV2全基因组扩增及测序以及序列分析等技术。
技术路线：
培养PK15细胞
细胞接毒
接毒细胞传代及培养
提病毒DNA
普通PCR
| 荧光定量PCR |
全基因测序
实验方案：
1.PK15细胞传代及培养：
细胞培养液：含5%胎牛血清的DMEM。根据需要选择传代比例，细胞密度达80%-90%时，去培养基，拿没有血清的培养基或者PBS清洗。加入3ml胰酶，置于37℃消化约15分钟，至细胞变圆，倒掉胰酶，加细胞培养液，用移液枪吹打细胞，吸取1/5散开的细胞液于新的细胞瓶中，再加入5ml细胞培养液，十字摇匀，置于37℃含5%CO2的恒温培养箱中静置培养约48h，直至长成致密的单层。
2.细胞接毒：
按10%的比例将PCV2病毒液接种到传代后已贴壁生长的正常PK15细胞的培养液中。
3.接毒细胞传代及培养：
同PK15细胞传代及培养。
4.提病毒DNA：
①吸取需要提取DNA的样品200μl于EP管中；②吸取600μl病毒裂解液与样品中，震荡30秒混匀，静置10分钟；③直接将EP管中的液体倒入离心吸附柱中，12000rpm离心1min。弃收集管中的穿透液，加入700μl通用洗脱液，12000rpm离心1min），倒掉穿透液，再12000rpm离心1min干甩一次；④离心吸附柱套入新1.5mlEP管中，加入30μlDNA洗脱液3.0，后12000rpm离心1min。
5.普通PCR：
①构建25μl反应体系：2×Mix 12.5μl、水8.5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模版（DNA）2μl；②跑pcr程序：；③跑琼脂糖凝胶电泳。
6.荧光定量PCR：
7.测序：送公司进行全基因测序。
可行性分析：
本课题依托江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室完成，该单位从事PCV2研究，相关仪器设备、实验材料、试剂耗材齐全，有老师指导，可满足本课题需要。4. 研究创新点
培育出能够在PK15细胞上稳定传代，且病毒滴度较高的PCV2d毒株。
5. 研究计划与进展
2018.12-2019.1 熟悉实验室各项操作和实验流程。
2019.2-2019.4正常PK15细胞和接毒PK15细胞获得稳定传代，并且每代接毒PK15细胞中能够利用PCR和核酸电泳检测到PCV2。
2019.5 利用荧光定量PCR检测获得的接毒PK15细胞中的病毒含量，测序。同时完成毕业论文的撰写和审核。
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