1. 研究目的与意义
原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是全球第三大肿瘤相关死因。随着医疗技术的不断进步，针对肿瘤的治疗方法也在不断的改进。但目前，绝大多数恶性肿瘤仍然依靠传统的手术、放射治疗、化学药物治疗作为基本的治疗手段。对很多进展性肿瘤，仍无法完全治愈。随着分子生物学及相关学科的发展PHC的基因治疗已成为继手术、放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种治疗模式。肿瘤基因治疗（gene therapy）定义为将核酸转移到肿瘤或者正常细胞，旨在通过直接杀灭细胞，免疫调节或修正错误的遗传信息和消除恶性增殖状态，使肿瘤消除。近年来，在恶性肿瘤的各种基因治疗中，自杀基因备受关注。
自杀基因治疗是指利用转基因方法将哺乳动物不含药物酶的基因转入肿瘤细胞内，该基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物影响细胞的DNA合成从而引起肿瘤细胞死亡。靶向基因治疗是指将目的基因通过载体系统导入机体,并特异性地在靶细胞中，以可调控的方式表达,达到治疗疾病的作用而不影响其他正常细胞组织或器官的功能[1,13]。自杀基因又称作药物敏感性基因，以其高度特异性的负选择标记杀伤多种耐药性肿瘤细胞等优势成为肝癌基因治疗的重要组成部分。
单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Herpes simplex virus Thymidinekinase，HSV-TK)是目前在众多的基因治疗方案中较为成熟的一种基因治疗系统。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK)基因能特异性地将核苷类似物丙氧鸟苷(GCV)单磷酸化进而在肿瘤细胞内代谢成三磷酸GCV。 三磷酸GCV是细胞DNA聚合酶的抑制子和DNA合成的终结子，可杀死分裂的肿瘤细胞。HSV-TK基因产物可使多种核苷酸类似物发生磷酸化，例如抗病毒药物“更昔洛韦”，DNA复制过程中，磷酸化的更昔洛韦可以终止DNA 链 3′-OH 端碱基的延长，从而终止DNA 的复制过程，导致细胞凋亡[2,3,11]。此外 HSV1-TK/GCV系统还可通过旁观者效应及诱导机体免疫反应使肝癌组织周围CD4 和CD8 T淋巴细胞大量浸润从而抑制肝癌细胞增殖[4,10]。
2. 研究内容和问题
本课题的基本内容
设计引物，从已知载体PCR获得目的基因，以构建HSV-TK基因的慢病毒表达质粒载体感染肝癌细胞，使目标基因进入肝癌细胞，最终对稳转肝癌细胞株进行筛选
预计解决的难题
3. 设计方案和技术路线
本课题的研究方法和技术路线如下：
1.以HSV-TK基因的上下游引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增 HSV-TK；
2.限制性核酸内切酶 Xba I和 BamH I对目的基因HSV-TK 和载体 PCDH 分别进行双酶切；
4. 研究的条件和基础
超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、小型离心机(SORVALL Legend MICRO 17)、PCR 仪（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler）、凝胶图像分析系统、摇床（Thermo Forma Orbital Shaker）、细胞房，分子生物学和遗传学知识和实验技能。
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