1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义：
FoxO1（forkhead box transcription factor O1）是一种能量代谢的重要调节因子，对糖脂代谢的调控起重要作用。团头鲂（Megalobrama amblycephala），也称为武昌鱼，鲤科，鲂属，以生长快，抗病力强，易饲养，肉质鲜美为特点，是我国主要淡水经济鱼类之一。前期研究结果发现，团头鲂无法有效利用日粮中高水平的碳水化合物。在摄食高碳水化合物日粮后，团头鲂会产生生长缓慢，免疫力降低，并出现高血糖和氧化应激等代谢障碍。
基于以上研究基础，我们想要探究foxo1基因的表达是否也参与了团头鲂高糖代谢调控，因此本实验在转录组研究的基础上进一步获取foxo1a基因全长，并通过灌喂高浓度葡萄糖溶液急性实验和投喂高糖日粮养殖实验对foxo1a在团头鲂摄食高糖后的时空分布进行分析，以期为团头鲂高糖代谢障碍的调控提供理论依据。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：
通过分子克隆实验，获得团头鲂叉头状转录因子（foxO1）基因编码区全序列，通过生物信息手段分析其序列特征，通过葡萄糖灌喂实验分析团头鲂foxO1的组织分布特征和糖代谢相应表达特征。
研究的内容：
3. 研究的方法与方案
（一）研究方法：
利用RNAiso Plus Reagent (Takara, Dalian, China)试剂盒、逆转录酶试剂盒M-MLV Kit (TaKaRa, Japan)、RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)试剂盒（Invitrogen No. 18374-058 和18373-019)扩增5’端和3’端序列，PCR产物用凝胶提取试剂盒(Sangon, China)进行纯化并在插入PMD-18T载体后用ABI3730 DNA 分析仪 (ABI, USA)进行测序。
应用GenBank的核苷酸和蛋白数据库BLASTX和BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对团头鲂Foxo基因进行序列分析。利用NCBI的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对foxo1a核苷酸和蛋白质序列进行同源性分析。推导的氨基酸序列通过ORF搜索获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)。
利用RT-qPCR技术，不同碳水化合物含量日粮饲养8周后团头鲂肝、肾、脑、脾和肠道组织foxo1表达量，以及高糖灌喂后0h, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h和48h团头鲂肝脏foxo1表达量。
（二）技术路线：
（三）实验方案：
1 实验动物
本实验所用实验鱼团头鲂均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉基地提供。挑选健康、规格均一的团头鲂幼鱼暂养于室内循环水养殖系统中，暂养周期为2周。循环水养殖系统每个养殖桶的体积为300L，并控制循环水流速为3L/min。暂养期间，水温控制在26.0 ± 1.5 °C，持续充氧，光周期同自然光照。暂养期间用常规商品料进行投喂。正式实验开始后，每天对养殖条件进行监测（水温26.0 ± 1.5 °C，溶氧≥ 6 mgL1; NH3 ≤ 0.1 mgL1; pH 6.8–7.0）。
2 团头鲂foxO1a mRNA全序列克隆及生物信息分析
2.1 团头鲂foxO1a mRNA全序列克隆
团头鲂组织中的总RNA按照RNAiso Plus Reagent (Takara, Dalian, China)试剂盒说明书要求进行提取。使用逆转录酶试剂盒M-MLV Kit (TaKaRa, Japan)合成第一链cDNA。通过表达序列标签（expressed sequence tags, ESTs)和注释分析发现了一系列团头鲂肝脏基因。转录组库中的一个ESTs与草鱼（Ctenopharyngodon idella ;KP325483.1)的foxO1a同源。选择该段序列作为团头鲂foxo1a基因序列。根据团头鲂转录组中已获得的foxo1a基因序列片段，通过RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)试剂盒（Invitrogen No. 18374-058 和18373-019)扩增5’端和3’端序列（表1）。PCR产物用凝胶提取试剂盒(Sangon, China)进行纯化并在插入PMD-18T载体后用ABI3730 DNA 分析仪 (ABI, USA)进行测序。
表1. 引物序列
Table 1. Primers used in this study.
| 引物 Primer name | 序列（5’-3’） Sequence (5’-3’) | 用途 Purpose |
| 5’ RACE 内引物 | GGCGGGGTTAGGGAACTC | RACE 扩增5’端 |
| 5’ RACE 外引物 | AGCGGCCAAGTGCAGGAG | RACE 扩增5’端 |
| 3’ RACE 内引物 | TCCGCTGGTTGGAAGAACTCAATTAGA | RACE 扩增3’端 |
| 3’ RACE 外引物 | AGGTTTATCCGTGTGCAGAATGAGGGG | RACE 扩增3’端 |
| FoxO1a-F | GACGAGCGGCCAAGAAAAAG | qRT-PCR 扩增FoxO1a |
| FoxO1a-R | TAAAAGGCGAGAGACGACCG | qRT-PCR 扩增FoxO1a |
| β-actin-F | TCGTCCACCGCAAATGCTTCTA | qRT-PCR 扩增β-actin |
| β-actin-R | CCGTCACCTTCACCGTTCCAGT | qRT-PCR 扩增β-actin |
2.2 核苷酸序列及生物信息学分析
应用GenBank的核苷酸和蛋白数据库BLASTX和BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对团头鲂Foxo基因进行序列分析。利用NCBI的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对foxo1a核苷酸和蛋白质序列进行同源性分析。推导的氨基酸序列通过ORF搜索获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)。利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对信号肽序列进行预测。团头鲂foxo系统发育分析采用MEGA 5.0软件中的neighbor-joining方法进行。
2.3 投喂不同糖水平日粮养殖试验及样品采集
以小麦粉作为糖源，酪蛋白、明胶和鱼粉作为蛋白源，大豆油和大豆卵磷脂作为脂肪源合成四组等氮（34%粗蛋白，干物质中）但含有不同水平碳水化合物（0%，17%，34%和51%）的半纯合日粮作为试验团头鲂日粮。将240尾（初始均重为27.5 ± 1.2g; mean ± SE）团头鲂幼鱼随机分为4组，分别是含51%小麦淀粉的高糖组（51WS），含34%小麦淀粉的适宜组（34WS），含17%小麦淀粉的低糖组（17WS）以及不含小麦淀粉的无糖组（0WS），每组设3个重复，共12个养殖桶，每桶20尾鱼。养殖期间每天人工投喂3次（08:00，13:00,和17:00）至表观饱食，养殖周期为8周。
8周养殖周期结束后，于采样前24h停止喂食。采样前，鱼体经过MS-222 (200 mg/L)麻醉剂轻度麻醉，防止产生过大应激反应。采集的肝、肾、脑、脾和肠道组织迅速放到液氮里，随后转移到-80℃冰箱保存，用以foxo1表达量的检测。
2.4 灌喂高浓度葡萄糖急性试验及样品采集
暂养14天后，将180尾（初始均重为19.94 ± 0.03 g; mean ± SE）团头鲂随机分为两组，分别是对照组（灌喂0.8%生理盐水）和处理组（灌喂3g葡萄糖溶液/kg体重），每组设3个重复，每个重复30尾鱼。
对照组和处理组分别在灌喂后0h, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h和48h采样。采样前，鱼体经过MS-222(200 mg/L)麻醉剂轻度麻醉，防止产生过大应激反应。采集的肝脏样品迅速放到液氮里，随后转移到-80℃冰箱保存，用以foxo1表达量的检测。
（三）可行性分析：
1. 实验技术和方法成熟：前期研究已获得团头鲂转录组数据库，为克隆获得团头鲂叉头状转录因子（foxO1）基因序列提供了基础，此外NCBI平台BLASTX和BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对工具、SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)信号肽预测等免费工具基因生物信息的分析提供了方便与可能。
2. 前期课题组已开展诸多鱼类糖代谢研究，为本实验实验方案的可行提供了支持。4. 研究创新点
目前国内外对FoxO1（forkhead box transcription factor O1）的研究很多，但对团头鲂叉头状转录因子（foxO1）的研究还不多，本课题致力于研究团头鲂foxO1，探索团头鲂foxo1基因的表达与团头鲂高糖代谢调控之间的关系，以期为团头鲂高糖代谢障碍的调控提供理论依据，最终将理论运用至实践。
5. 研究计划与进展
2019.07：以研究目的和内容核心，对相关资料进行收集和翻阅。
对已搜集的资料加以整理，论证分析论文的可行性、实际性。
2019.08：利用前期研究已获得的团头鲂转录组数据库，对团头鲂FoxO1基因进行克隆。
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