1. 研究目的与意义
麦角生物碱（ergot alkaloilds，EA）简称麦角碱，是由麦角菌属（Claviceps）侵害黑麦、大麦、小麦、裸麦、燕麦以及多种禾本科植物而产生的生物碱毒素。目前已知的麦角碱有50多种，根据C-8取代基结构的不同可以将麦角碱分为四类：棒麦角生物碱、简单麦角酸衍生物、肽型麦角碱和酰胺类麦角生物碱。
天然麦角碱广泛存在于作物、食品、牧草和饲料中，对人类健康和畜牧业的发展产生影响。麦角毒素主要作用于外周和中枢神经系统，临床症状为痉挛、共济失调、流产、泌乳抑制、坏疽等。目前麦角中毒在人类中发病的情况基本消除，但是动物的麦角中毒仍然是阻碍畜牧业发展的问题之一，特别是奶牛、马、绵羊、猪和雏鸡的染病几率更高。有报道称，在美国，每年由麦角中毒对畜牧业造成的损失高达十亿美元。
由于麦角毒素的危害作用，及时监测并制定相关的限量标准已成为世界各国关心的问题，但由于麦角生物碱种类繁多，并且各个生物碱的含量不同，而没有建立统一的限量标准。德国和瑞士规定总麦角碱在谷物和人们消耗品中的限量分别是400～500μg/kg、100μg/kg。我国规定每1kg粮食中检出麦角不得超过0.1g。
2. 文献综述
麦角生物碱检测方法研究进展
平 雪 繁
摘 要：麦角生物碱是一类由麦角菌属产生的真菌毒素，易引起人和动物麦角中毒，从而影响人类健康和畜牧业的发展。本文概述了麦角碱的结构和性质，系统介绍了与其相关的各种检测方法，并对这些方法的优缺点和发展趋势进行了评述和展望。
关键词：麦角生物碱；检测方法；研究进展
麦角生物碱（ergot alkaloilds，EA）简称麦角碱，是由麦角菌属（Claviceps）侵害黑麦、大麦、小麦、裸麦、燕麦以及多种禾本科植物而产生的生物碱毒素。目前已知的麦角碱有50多种[1]，根据C-8取代基结构的不同可以将麦角碱分为四类：棒麦角生物碱、简单麦角酸衍生物、肽型麦角碱和酰胺类麦角生物碱。它们的基本化学结构都是四环麦角灵（ergoline），在N-6位甲基化，不同的麦角碱C-8被不同的基团取代，C-8，C-9 或C-9，C-10之间存在双键。由于C8位有不对称原子，所以麦角碱可以发生异构化（由8R转变成8S），形成差向异构体，如麦角克碱（ergocristine）和麦角异克碱（ergocristinine），麦角胺（ergotamine）和麦角胺宁（ergotamnine）等。麦角碱及其差向异构体之间的转换在水溶性酸、碱溶液中进行得很快，光照也会引发麦角碱的异构化和降解[2]。
天然麦角碱广泛存在于作物、食品、牧草和饲料中，对人类健康和畜牧业的发展产生影响。麦角毒素主要作用于外周和中枢神经系统，临床症状为痉挛、共济失调、流产、泌乳抑制、坏疽等。目前麦角中毒在人类中发病的情况基本消除，但是动物的麦角中毒仍然是阻碍畜牧业发展的问题之一，特别是奶牛、马、绵羊、猪和雏鸡的染病几率更高[3]。
由于麦角毒素的危害作用，及时监测并制定相关的限量标准已成为世界各国关心的问题，但由于麦角生物碱种类繁多，并且各个生物碱的含量不同，而没有建立统一的限量标准（表2）[4]。德国[5和瑞士[6]规定总麦角碱在谷物和人们消耗品中的限量分别是 400～500μg/kg、100μg/kg。我国规定麦角碱在粮食作物的检测限量为0.01%[7]。欧盟规定麦角碱在黑麦中的检测限量为0.1%[8]。
表2 部分国家和地区粮食谷物中麦角限量标准
Table 2 Limitation standard of ergot in food grains in some countries and regions
国家(地区) | 欧盟 | 美国 | 加拿大 | 英国 | 保加利亚 | 日本 | 中国 |
小麦麦角 限量标准 | 0.05% | 0.3% | 0.06%(国内食用)， 0.01%(出口) | 0.001% | 0.02% | 0.04% | 0.01% |
天然麦角碱检测方法主要包括光谱分析法、质谱分析法、电泳分离分析方法、色谱分离分析方法、仪器联用分析法和免疫分析法，本文评述了各种方法的优缺点，提出了目前天然麦角碱检测方法存在的问题，并对今后的研究进行了展望。
1. 光谱分析法
1.1 比色法
比色法（Colorimetric Analysis）主要是基于麦角碱与其他试剂结合物的颜色深度实现对麦角碱的检测。比色法相对简单、仪器设备易得、样品分析时间短，是研究早期应用于天然麦角碱检测中的方法。但该方法难于区分麦角碱及其同分异构体，而且随着分析要求和检测手段的进步，该方法的灵敏度和准确性等也越来越难满足要求。
Robbers等[9]采用比色法检测黑小麦中的生物碱，但此方法不能区分麦角生物碱的差向异构体。
1981年，Young等采用比色法对黑麦麦角菌硬粒中的麦角碱总量进行了分析。试验发现，同一植株、同一片种植地和同一地区的麦角菌硬粒的麦角碱总量之间有很大差别，为0.011％～0.452％（平均值为0.249％）。
1.2 近红外光谱法
近红外光谱法（Near-Infrared Spectroscopy，NIR）前处理方法简单，应用领域广泛，鉴别能力较强，可以有效应用于麦角碱的定性分析。但是它的分析技术复杂，摩尔吸光系数约比中红外谱区低一个或几个数量级，分析准确度较差，一般难以进行麦角碱的微量分析。
Roberts等[10]建立了NIR检测高羊茅中麦角碱总量的方法。该方法与免疫学方法相结合，以405 nm波长处测得的吸光度值作为NIR校正方法的参比值，样品扫描波长为1 110～2 490 nm，每组吸光度值都利用参比值进行校正。实验建立的校正方法的精确性要优于前人的方法，全部样品2次校正的1．VR分别为0．72和0．89，CV值分别为25％和16％。
1.3 核磁共振波谱法
核磁共振波谱法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）中的13C-NMR和1H-NMR在麦角碱的结构分析鉴定中发挥着重要作用。目前，大多情况下光谱分析法是作为麦角碱的定性方法，并未广泛应用于定量分析中。但是，NIR和NMR等分析方法以其在化合物结构鉴定与分析方面的独特优势，为人们提供更多与麦角碱相关的结构信息与性质，在麦角的定性分析上发挥着重要的作用。
1974年，Harold等利用NMR得到了几种棒麦角素和麦角酸衍生物的核磁共振氢谱（pmr）谱图和碳谱（cmr）谱图。试验通过分析以上麦角碱的分子式、化学位移、耦合常数和化学环境，给出了它们的分子结构式。此外，他们通过分析得到的13C波谱图证实了麦角碱化学立体结构的存在。
2. 毛细管电泳法
毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE）是20世纪80年代兴起的分离分析方法，它包含了电泳、色谱及其交叉内容。目前，该方法被越来越多地引入到生物碱的检测领域中。CE具有操作简单、分析时间短、适应性广、进样量小等优点，对麦角碱的分离分析效果也较为理想。尽管毛细管直径小，光路短，使用一些检测方法时，灵敏度较低。而且电渗会因样品组成而变化，会影响分离的重现性。但是作为一种相对高效、快速、省时的检测方法，它在农业，食品工业，制药行业等多个领域发挥着独特的作用，为麦角碱的检测方法提供更多的选择。
Frach等[11]提出了CE检测黑麦中麦角考宁、麦角隐亭、麦角辛、麦角克碱、麦角胺和它们的同分异构体的方法。最佳柱温为20℃，电压为23 kV，并考查了在50 mmoL/L磷酸盐缓冲液（pH 2.5）中添加不同表面活性剂对分离度的影响，结果表明，添加20 mmoL/Lβ-环糊精、8 mmoL/L γ-环糊精、2 moL/L尿素和0．3%聚乙烯醇（PVA）可以达到最佳的的分离效果。该方法的加标回收率为87.2%～104.6%，RSD值为0.9%～4.5%，实际样品的检测浓度为0.2～49.5μg/mL。
3. 质谱分析法
质谱分析法（Mass Spectrometry，Ms）的定性分析能力较强，常用于麦角碱的结构鉴定。质谱仪可以单独使用对麦角碱进行定性分析，但是单级质谱无法对不同的麦角碱进行分离，因此多数情况下，质谱仪与色谱仪联用，作为色谱仪的检测器，应用于麦角碱的检测分析中。
Andreas等[12]采用电喷雾串联四级杆质谱对高羊茅中的麦角碱进行结构分析。优化的主要质谱参数为：毛细管电压3.15 kV，锥孔电压30 V，碰撞能24～32eV。试验得到了麦角瓦灵、麦角胺、麦角柯宁碱、麦角隐亭、麦角克碱、麦角新碱、麦角醇和麦角酸的标准质谱图，并分析了它们的裂解机理和产生的碎片离子。
4. 色谱分离分析方法
4.1 薄层色谱法
薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）简便、快速、成本低，是较早被广泛应用的一种检测方法，适合成分简单的样品的定性及半定量。由于大部分天然的麦角生物碱拥有C9==C10双键（棒麦角素生物碱除外），因此，可通过它们的荧光性在紫外可见光下检测。上个世纪六、七十年代，TLC是分离和检测麦角碱的主要方法，但由于TLC分离麦角碱及其同分异构体的能力有限，到了80年代，TLC开始被液相色谱法所替代。
曾丽娟等[13]叫通过大孔树脂D-101吸附法提取雀稗麦角菌发酵液中麦角总碱粗品。硅胶层析分离上样量与硅胶质量比为1：20，单因素试验确定去杂洗涤剂为氯仿：甲醇=5：1（体积比）的混合液，依次洗涤5次。用氯仿-甲醇（2：1，体积比）的洗脱剂洗脱，得到麦角总碱，回收率为77.6%。
4.2 气相色谱法
气相色谱法（Gas Chromatography，GC）一般要求被分析物在一定温度下易气化且在气化温度下较稳定。采用GC检测肽型麦角碱时，肽型麦角碱在进样口温度（250～300℃）下不稳定、易分解，肽型麦角碱会发生热分解，产生缩氨酸部分。利用MS可以区分肽型麦角碱和其他麦角碱，但对于肽型麦角碱的差向异构体，如：麦角胺和麦角胺宁，则不能进行区分。因此，GC在天然麦角碱的检测应用中受到限制，相关报道也较少。
Klug等[14]建立了定量分析谷物中14种麦角碱的高效液相色谱方法，并利用TLC和GC-MS对试验结果进行验证。结果显示，该试验从市场上采集的所有谷物产品样品中麦角碱的含量均低于1 mg/kg。
4.3 高效液相色谱法
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是色谱法的一个重要分支，它是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速度，高分离效率和高检测灵敏度的分离分析方法。随着紫外吸收检测器、荧光检测器和质谱检测器等多种检测器的发展，HPLC在麦角碱检测方面的应用得到了迅速的推广。HPLC在多组分分离，定量检测和选择性方面明显优于TLC。而且HPLC与GC不同，不会因为温度对麦角碱的影响而受到限制。虽然，HPLC也存在样品前处理复杂，耗时长，不适用于现场快速检测等缺点。但HPLC仍然是多种麦角碱同时检测的常用方法。
George等[15]提出了HPLC定量检测高羊茅种子和植株组织中麦角碱的方法。麦角瓦灵和麦角胺的回收率为85%和88%，麦角瓦灵的检测限为50μg/kg。试验分析了不同生长期，高羊茅不同部位中麦角瓦灵的含量，结果显示，叶鞘和叶片中麦角瓦灵的浓度没有随生长期而发生明显变化，种子中麦角瓦灵的浓度随生长期而增加。Martin等[16]比较了3种提取液：氯仿-甲醇-氨，乙酸和丙醇-乳酸对牧草中麦角瓦灵的提取效果，证明丙醇-乳酸的提取效果最好，麦角瓦灵平均回收率为99%。
4.4 超高效液相色谱法
超高效液相色谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）作为分离科学中的一个全新类别，涵盖了小颗粒填料和快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。但是UPLC价格较高，对流动相和样品前处理的要求也较高，使得UPLC的推广应用受到限制。目前，已有研究人员将UPLC应用于麦角碱的检测中。
Jana等[17]建立了UPLC检测麦角菌硬粒中麦角克碱的方法。该研究以甲醇-水-NH4OH（80：20：0.1，体积比）为提取液，检测波长225 nm和310nm，采用光电二极管阵列检测器，Waters BHE C18色谱柱，水（含0.04% NH4OH）和乙腈（含0.04% NH40H）为流动相进行梯度洗脱。麦角克碱的定量限为o．78μg/mL，RSD值为2.6%。该方法可以用于麦角菌硬粒、培养基、菌丝和食品中麦角克碱的定量检测。
4.5 超临界流体色谱法
超临界流体色谱法（Supercritical fluid chromatography，SFC）是以超临界流体作为流动相的一种色谱方法，是仪器检测技术中对GC和HPLC等方法的补充。SFC不会因为待测物的挥发性和沸点使检测方法受到制约。SFC较HPLC而言，分析时间更短，分析效率更高。但是仪器制造复杂，价格昂贵，且流动相的选择也受到限制。
早在1986年，Antony等就利用SFC和SFC-MS对一些极性化合物进行分离和分析。该方法采用100mm4.6 mm毛细管柱，检测波长280 nm，流动相为C02和甲醇，梯度洗脱系统。试验根据保留时间的不同，分离了麦角菌中的田麦角碱、羊茅麦角碱、野麦碱、裸麦角碱Ⅰ和裸麦角碱Ⅱ。
5. 仪器联用分析法
仪器联用分析方法是将色谱仪作为质谱仪的进样系统，质谱仪作为色谱仪的检测器，将色谱仪的高分辨能力与质谱仪的高鉴别能力结合起来，发挥2种仪器的长处。目前，液相色谱串联质谱法已经成为麦角碱定量分析中常用方法。此方法在灵敏度和准确性方面具有突出优势，可以作为麦角碱的确证性分析方法。而液相色谱与串联质谱（MS/MS）联用技术使得天然麦角碱这种大分子物质分离后，与高选择性、高灵敏度的MS/MS相结合，可对多组分复杂样品进行检测，并显著提高信噪比。但液相色谱存在的弊端，如样品前处理复杂、耗时，不适用于大量样品和现场检测等也是仪器联用分析法的缺陷。另外，液相色谱仪和质谱仪之间的接口也是仪器联用技术的瓶颈，麦角碱检测中常用的接口为电喷雾电离（ESI）。
Lori等[18]采用C18色谱柱，梯度洗脱系统，单离子检测扫描，利用LC-MS对血管组织中的7种麦角碱(麦角酸、麦角新碱、麦角瓦灵、麦角柯宁碱、麦角胺、麦角隐亭和麦角克碱)同时进行检测。试验通过配置基质标准溶液以抵消基质效应，回收率为68.4%～111.0%，检测限为0.05 pmol，定量限为0.1 pmol。
Seppo等[19]探讨了刈割频率对高羊茅和多年生黑麦草中麦角碱含量的影响。试验利用HPLC-MS对刈割频率为每周一次和每两周一次的样品进行检测，结果显示刈割频率与高羊茅和多年生黑麦草中麦角碱的含量呈负相关。
6. 免疫分析法
6.1 放射免疫检测
最初的免疫方法以放射免疫检测（radioimmunoassay，RIA）居多。虽然该方法特异性强、灵敏度高，但是检测中使用放射性标准品，对工作人员有害。所以，关于麦角碱的RIA 分析报告目前已经很少，研究者把兴趣投向了更有发展前途的领域，即酶联免疫吸附法。
6.2 酶联免疫吸附法
在已经发展的多种免疫分析法中，目前酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是麦角碱检测中最常用的方法。ELISA具有检测时间短、特异性强、仪器设备和样品前处理简单的特点，适用于大批量样品筛查与现场检测。然而也存在酶标记抗体保存时间有限且用量大，交叉反应，可能出现假阳性和假阴性等弊端。但是作为一种现场检测和快速初筛的分析手段，ELISA可以与其他检测技术互为补充，在农产品质量安全控制和药物监查方面显示出独特的优势。
John等[20]采用ELISA对高梁和饲料中双氢麦角胺（DHES）进行检测。试验制备了小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体。该方法回收率为77%～103%，DHES的检测限大于0.01 mg/kg，定量限为0.1 mg/kg。利用单抗和多抗分析该方法的交叉反应率，麦角胺和双氢麦角氨仅在10000 ng/mL或更高的浓度有较小的交叉反应，且试验结果与HPLC分析结果表现出较好的相关性。
7．结语
在目前已经发展的多种分离和分析麦角碱的方法中，高效液相色谱法、高效液相色谱一质谱联用分析法和酶联免疫吸附法是最具普遍应用价值的方法。前2种分析方法的灵敏度和准确性高，适用于麦角碱检测方法的标准化。但样品的前处理复杂，耗时较长，在大量样品检测和现场快速检测方面存在弊端。麦角碱的免疫分析法具有高灵敏性、高特异性、前处理方法省时、受基体干扰小、仪器和设备简单等优点。然而，免疫分析法也有自身的局限性，试验重复性和定量方面的准确性都不及仪器分析方法，会出现假阳性和假阴性，交叉反应也会对试验结果产生影响。因此，在生产实践中，应该根据实际的检测要求，选择合适的检测方法，对样品快速、准确地进行检测和分析。
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3. 设计方案和技术路线
1、文献分析
为了从麦角生物碱的相关研究进展中找到最新最合适的现代化检测方法，以各种数据库为检索对象，以基于频次统计的数据挖掘方法，对关于麦角生物碱检测方法研究进展的内容进行了系统的统计及分析、评价。
2、检测方法初步设计
4. 工作计划
一、2022年1-3月：检索信息，查阅文献，确定实验选题；考量实验条件，设计实验方案，完成开题报告；熟习相关仪器操作。
1、文献分析结果
通过查阅关于麦角生物碱检测方法研究进展的相关文献，比较了现有的检测方法如光谱分析法、毛细管电泳分离分析方法、高效液相色谱分离分析方法、免疫分析法等，在分析了各种检测方法的优缺点之后，确定了本实验课题选用HPLC-MS/MS。
5. 难点与创新点
1、关于麦角生物碱的检测，现有的一些方法均存在分离效果不理想、灵敏度不高等问题，而液质联用的检测方法在灵敏度和准确性方面具有突出优势，并且可对多组分复杂样品进行检测，因此选择此方法进行麦角生物碱标准检测方法的研究。
2、本实验优化了麦角生物碱液质联用检测方法的液相和质谱参数，研究了提取方法、净化方法和基质效应等影响因子，建立了多种麦角生物碱的LC-MS/MS检测方法，并进行全面的方法学评价。
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