关于急性皮肤腐蚀的新型体外皮肤模型的验证研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究内容：经皮给药制剂的设计和处方优化中需要大量应用动物或人的皮肤开展透皮吸收实验,而真实皮肤的使用越来越受到限制,并且质量的重现性得不到保证,这为人工皮肤模型的发展提供了需求基础。脂质人工皮肤膜是以脂质成分为基质、 模仿皮肤的脂质组成或结构从而模拟皮肤屏障功能的模型,可作为药物高通量筛选的工具,并且其组成或结构可根据需要进行调整,从而能够灵活适用于不同的研究。

研究意义：经皮给药传递系统是继口服、注射之后的第三大给药系统,它能避免肝脏及胃肠道首过效应,具有缓释长效、降低毒副反应、用药方便、患者顺应性好等优势。近年来不断有新技术应用到经皮给药系统中,如脂质体微针技术、 微透析技术等。而脂质人工皮肤膜具有可塑性强、方便、 高通量等优点,在经皮给药制剂的前期研究和处方筛选中的应用越来越受到科研工作者的关注。

2. 文献综述

脂质人工皮肤膜的研究进展

黄慧 南京中医药大学

摘 要：经皮给药制剂的设计和处方优化中需要大量应用动物或人的皮肤开展透皮吸收实验,而真实皮肤的使用越来越受到限制,并且质量的重现性得不到保证,这为人工皮肤模型的发展提供了需求基础。脂质人工皮肤膜是以脂质成分为基质、 模仿皮肤的脂质组成或结构从而模拟皮肤屏障功能的模型,可作为药物高通量筛选的工具,并且其组成或结构可根据需要进行调整,从而能够灵活适用于不同的研究。笔者综述常用脂质人工皮肤膜的组成、 制备、 应用、 表征技术等,并对未来的前景进行展望。

关键词: 经皮给药; 动物皮肤; 人皮肤; 脂质人工皮肤膜

不管是局部给药还是全身给药, 经皮给药制剂处方的设计和优化都需要一个能够准确地识别和评估处方内在性质和特点的皮肤模型。如果能够确定处方中影响药物渗透的关键特性,就能对该处方进行优化。

由于近年动物在实验中的使用越来越受到限制,体外模型被越来越多地应用到皮肤渗透和皮肤刺激性研究中。最初,Ponec等^［1］将人角质形成细胞接种在薄膜上使其增殖分化而形成一种皮肤等价物,并作为皮肤刺激性的模型。之后利用此方法衍生了几种商业化的替代人表皮(EpiSkin,EpiDerm,SkinEthic)或全皮(Phenion)^［2］的人工皮肤模型。这些模型多用于皮肤的光毒性、刺激性研究中, 近年来也有人将其应用到药物的透皮研究中。但研究发现这些重组的皮肤模型与人皮肤相比,药物的通透性过高^［3］,并且昂贵的价格和较长的培养周期也限制其在药物透皮研究中的使用。

为了简化药物皮肤渗透性的预测,几种体外模型已经被提出,如硅氧烷膜^［4］ 、角质层替代物模型( SCS)^［5］、皮肤平行人工渗透模型( skin-PAMPA)^［6］、磷脂囊泡基质渗透模型( the phospholipid vesicle-based permeation assay,PVPA) ^［7］等。这些模型具有高通量、制备简单、可修饰性强等优点。笔者重点介绍以脂质为基质的人工皮肤模型skin- PAMPA、PVPA的研究进展。

1.角质层的屏障作用人的皮肤由外到里由表皮层,真皮层和皮下组织构成。而角质层位于表皮层的最外层,是皮肤的主要屏障^［8］。角质层主要由角质细胞和细胞间脂质构成。其中,角质细胞中含有丰富的角蛋白和天然保湿因子( natural moisturizing factor,NMF),因此角质细胞本身具有亲水性,含非极性脂类的细胞间脂质具有疏水性,填充于角质细胞之间,形成特殊的砖-砂浆结构^［9］。1.1 角质细胞在正常分化的最后阶段,角蛋白通过聚丝蛋白( 一种基质蛋白) 紧密而有序地排列。聚丝蛋白使角蛋白丝聚集成束,从而促使细胞变形成扁平状,形成角质细胞。动物表皮蛋白的80%～90%是由角蛋白和聚丝蛋白构成。聚丝蛋白对表皮屏障的内平衡十分重要,该蛋白在小鼠表皮的过度表达会延迟皮肤屏障功能的修复^［10］。角质细胞的外面包裹着一层由脂质或蛋白质聚合而成的坚固包膜,称为角质细胞被膜,由蛋白包膜和脂质包膜组成。蛋白包膜由外皮蛋白,兜甲蛋白,毛透明蛋白以及一类富含脯氨酸的小分子蛋白质交联而成。特定敲除小鼠角质细胞被膜中外皮蛋白的基因,并不会影响皮肤的屏障功能,但降低了皮肤的修复功能,因此实验性渗透屏障破坏会导致外皮蛋白的过度表达^［11-12］。脂质包膜是一种质膜样结构,它可以取代哺乳动物角质层细胞外表面的质膜^［13］。1.2 细胞间脂质细胞间脂质构成了砖-砂浆结构中的砂浆。主要由近等摩尔的神经酰胺( ceramide)、游离脂肪酸(free fatty acid)和胆固醇( cholesterol) 组成。其中,神经酰胺类约占角质层脂质质量的30%～40%,神经酰胺是由一分子鞘氨醇与一分子脂肪酸通过酰胺键结合的化合物^［14］,其中的鞘氨醇部分、脂肪酸部分的碳链长度、不饱和度和羟基数目都是可以变化的,所以神经酰胺是一类化合物而不是一种化合物。皮肤角质层包含有至少 9 种以上的游离神经酰胺,其中神经酰胺A和神经酰胺B与蛋白包膜共价结合,对外皮蛋白非常重要^［15］。在角质层中,神经酰胺具有保水作用并与经皮水分流失密切相关,从而进一步提高了皮肤屏障功能。

游离脂肪酸是皮肤角质层中另一重要的结构性组分,主要由链长C12～C24的脂肪酸构成,如棕榈酸。饱和与单不饱和脂肪酸类在表皮内合成,其他的从食物和血液中获得。必需脂肪酸缺乏症( EFAD)是因营养不良或者不正常饮食造成表皮游离脂肪酸的缺乏。由于表皮细胞的改变,在实验小鼠身上表现为皮肤发红、 表皮粗糙、脱屑,严重时可导致皮肤屏障功能障碍^［16］。另外,脂肪酸运输蛋白4(Fatp4)基因表达异常可致皮肤屏障功能异常并可促使小鼠在出生后迅速死亡^［17］。胆固醇是存在于角质层的第三大脂类,约占25% ,与皮肤通透性屏障密切相关。角质层中胆固醇水平受 ABCA12膜转运蛋白的调节^［18］。研究发现,在皮肤通透性屏障功能修复过程中胆固醇的合成明显增加^［19］; 降脂药洛伐他汀的局部应用可抑制羟甲基-CoA 还原酶, 促使表皮过度增生并导致皮肤屏障功能异常^［16］。2. 脂质人工皮肤模型在透皮给药制剂的设计和处方筛选中,需要使用大量的体外皮肤模型,而真实皮肤往往存在种属、个体、部位等差异,质量的重现性得不到保证,且存在伦理问题,这些使得皮肤的使用越来越受到限制。这为脂质人工皮肤模型的发展提供了基础。脂质人工皮肤模型是以脂质成分为基质、模仿皮肤的脂质组成或结构从而模拟皮肤屏障功能的模型,作为处方快速筛选的工具,具有高重现性、高通量、制备简单、可修饰性强等优点。下面重点介绍skin-PAMPA、PVPA 2类脂质人工皮肤模型的研究进展。2.1 skin-PAMPA 模型Kansy等^［20］将卵磷脂的有机溶液涂布在聚偏氟乙烯或者聚碳酸酯膜上,卵磷脂能够在小孔孔隙中心部分形成非常稳定的薄膜; 利用这种在支撑材料上成膜的性质,建立了PAMPA 模型( parallel artificial membrane permeability assay),试图模拟口服给药中药物在胃肠道中的被动扩散吸收状态。之后,由于 PAMPA 模型的高通量、低成本、检测方便等优势,被广泛应用到药物剂型的前期研究中。Skin-PAMPA 是由 PAMPA 发展而来的,在2006年,Ottaviani等^［21］ 用二甲基硅油和十四烷酸异丙酯的混合物作为PAMPA的脂质层模拟皮肤吸收,得到的有效渗透系数Pe与人皮肤的渗透系数Kp比较,发现当十四烷酸异丙酯-二甲基硅油为70∶30 时,相关系数最高(r²=0.81)。Karadzovsk等^［22］同时应用Skin- PAMPA, 无磷脂的Skin-PAMPA 以及市售Strat-MTM来评价咖啡因、可的松等6个药物分别在丙二醇、水、乙醇中的渗透的作用,3 个模型的渗透结果与猪皮肤扩散数据比较,相关系数r²分别为0.66、0.63、0.60。说明Skin-PAMPA 模型作为预测皮肤渗透性的工具有很大潜力。Sink等^［6］参照皮肤中脂质组成,将神经酰胺类似物与硬脂酸和胆固醇混合,来模拟皮肤的屏障功能; 并且将Skin- PAMPA中的渗透系数Pe与人的表皮、角质层、全皮的渗透系数Kp进行比较,发现该模型与全皮的相关性最好(r²=0.89),再次证明该模型能够很好的模拟皮肤渗透。Tsinmam 应用 Skin-PAMPA 评价布洛芬透皮制剂的3个处方,发现该模型能很好的区分3个处方并且布洛芬的渗透数据和用人皮肤在franz扩散池的数据一致^［23］。2.2 PVPA 模型近年来提出了一种模拟皮肤角质层屏障的新模型PVPA 模型。最初的 PVPA 模型是由Flaten等^［28］提出,用做药物在肠道渗透性研究的模型。该模型由支撑膜和膜上紧密堆积的脂质体层组成,模拟生物屏障。Flaten等^［24-26］ 认为PVPA 模型具有作为药物高通量筛选模型的潜力,并且可以通过对脂质体组成的调整来模拟不同的吸收屏障。2种用来评估药物皮肤渗透性的Skin-PVPA模型被提出,分别是PVPAc和PVPAs。PVPAc 是由用卵磷脂和胆固醇制备的脂质体制得,PVPAs用皮肤中主要的脂质成分神经酰胺,胆固醇,游离脂肪酸,胆固醇硫酸酯等制备。Engeslang等^［7］检测了6个药物在这两个模型中的渗透率,并与文献中这些药物在不同动物皮肤中的渗透率比较,大部分药物的渗透顺序和动物皮肤一致。为了考察 PVPA 膜的完整性,一般通过测量膜电阻和水溶性钙黄绿素的渗透率来表征。电阻过低和钙黄绿素的渗透率过高都提示膜的完整性可能被破坏。随后,skin-PVPA 模型应用到药物载体对透皮吸收的影响。Palac等^［27］以PVPAc 和PVPAs 为渗透屏障考察了模型药物双氯芬酸钠的溶液剂与普通脂质体,变形脂质体,醇质体 3 种载体制剂的渗透行为。结果显示,与溶液剂相比,在PVPAs 中,3种脂质体制剂均促进了双氯芬酸钠的渗透,而在PVPAc 中4 种剂型的渗透无明显差别。为了进一步证明skin-PVPA 模型在药物处方研究中的潜力,Enges- land 比较了skin-PVPA模型和市售的EpiSkin模型在区别3个模型药物( 阿昔洛韦、咖啡因、氯霉素) 的溶液剂和脂质体制剂渗透行为的能力。渗透实验结果显示,PVPAs 模型能有效区分药物溶液剂和脂质体制剂,而在EpiSkin 模型中,2种剂型无明显差别。由此可看出在药物早期研究中,PVPA模型是比EpiSkin模型更加有效简便的预测药物渗透性的模型^［28］。以上 2种脂质人工皮肤模型都可以作为制剂处方设计和优化的工具,但各自的优势不同。Skin-PAMPA 模型和PVPA模型可用作高通量的筛选工具,主要应用于预测药物在皮肤的渗透性评价以及剂型的优化。Skin-PAMPA 模型和PVPA 模型都是由一开始的模拟胃肠道屏障,之后逐渐发展到模拟皮肤屏障。不同之处在于PVPA 模型不仅模拟角质层的脂质组成,还应用脂质体来模拟角质细胞的结构和形态特征,从而更好地模拟角质层。但是既然是预测药物的透皮吸收行为,则药物在模型中的渗透性与人皮肤的相关性是评价模型的重要依据。Skin-PAMPA模型与人皮肤的不同部位的渗透相关性系数r²受皮肤的部位、温度等影响,在 37℃条件下Skin-PAMPA模型与人全皮的相关系数最高,见表1。尽管 Engeslang 等^［7］比较了不同药物在PVPA模型和真实皮肤( 鼠皮、猪皮、狗皮、牛皮) 中的渗透效果,而 PVPA 模型与人皮的相关系数r²尚未见报道。表 1 不同药物在 Skin-PAMPA 模型与人皮肤中的渗透相关性

注: 1)的数据来自网站 http://www.chemspider.com

3. 展望

经皮给药传递系统是继口服、注射之后的第三大给药系统,它能避免肝脏及胃肠道首过效应,具有缓释长效、降低毒副反应、用药方便、患者顺应性好等优势^［29］。近年来不断有新技术应用到经皮给药系统中,如脂质体微针技术^［30］、 微透析技术^［31］等。而脂质人工皮肤膜具有可塑性强、方便、 高通量等优点,在经皮给药制剂的前期研究和处方筛选中的应用越来越受到科研工作者的关注。国内有关人工皮肤膜用于透皮实验的研究非常少,壳聚糖膜、硝酸纤维素膜曾被应用到药物体外透皮研究中^［32-33］,但都存在制备工艺较粗糙、缺少评价指标、缺少表征技术等问题。应向国外一些先进的研究机构学习,人工皮肤膜的制备和质量控制方面还有待进一步标准化,如形成标准的工艺流程、制定质量标准等^［34］, 这样有利于形成大规模的商业化生产。

参考文献

［ 1 ］ PONECM．In vitro cultured human skin cells as alternatives to animals for skin irritancy screening［J］．Int J Cosmet Sci,1992,14( 6) :245-264．［ 2］VANGELEM,GEUSENSB,BROCHEZ L,et al．Three dimensional skin models as tools for transdermal drug delivery: challenges and limitations［J］．Expert Opin Drug Deliv,2011,8 ( 6) :705-720．［ 3］ SCHMOOKFP,MEINGASSNERJG,BILLICH A．Comparisonof human skin or epidermis models with human and animal skin inin vitro percutaneous absorption［J］．Int JP-harm,2001,215( 1-2) : 51-56．［ 4］ OLIVEIRAG,BEEZERAE,HADGRAFTJ,et al．Alcohol enhanced permeation in model membranes．Part I．Thermodynamicand kinetic analyses of membrane permeation［J］．Int J P-harm,2010,393( 1-2) : 61-67．［ 5］ DEJAGERM,GROENINKW,BIELSAI,et al．A novel in vitropercutaneous penetration model: evaluation of barrier propertieswith paminobenzoic acid and two of its derivatives［J］PharmRes,2006,23( 5) : 951-960．［ 6］ SINKB,GARRIGUESTM,BALOGHGT,et al.Skin-PAMPA: a new method for fast prediction of skin penetration［J］.EurJ Pharm Sci,2012,45( 5) : 698-707．［ 7］ ENGESLANDA, SKARM, HANSENT, et al．New applicationsof phospholipid vesicle-based permeation assay: permeation modelmimicking skin barrier［J］. J Pharm Sci,2013,102( 5) : 1588-1600．［ 8］ TROMMERH,NEUBERTRH．Overcoming the stratum corneum: the modulation of skin penetration［J］．Skin Pharmacol Physiol,2006,19( 2) : 106-121．［ 9］ MENONGK,CLEARYGW,LANEME．The structure andfunction of the stratum corneum［J］．Int J Pharm,2012,435( 1) :3-9．［ 10］ PRESLANDRB,COULOMBEP A,ECKERTRL,et al． Barrier function in transgenic mice overexpressingK16,involucrin,andfilaggrin in the suprabasal epidermis［J］．J Invest Dermatol,2004,123( 3) : 603-606．［ 11］ EKANAYAKE-MUDIYANSELAGES,ASCHAUERH,SCHMOOKFP,eta- l．Expression of epidermal keratins and the cornified envelopeprotein involucrin is influenced by permeability barrier disruption［J］．J Invest Dermatol,1998,111( 3) : 517-523．［ 12］ DJIANP,EASLEYK,GREENH．Targeted ablation of the murine involucrin gene［J］．J Cell Biol,2000,151( 2) : 381-388．［ 13］ SWARTZENDRUBERDC,WERTZPW,MADISONKC,etal．Evidence that thecorneocyte has a chemically bound lipid envelope［J］．J Invest Dermatol,1987,88( 6) : 709-713．［ 14］ PULLMANNOV P ,STANKOV K,POSPILOV M,et al．Effects of sphingomyelin /ceramide ratio on the permeability andmicrostructure of model stratum corneum lipid membranes ［ J］ ．Biochim Biophys Acta,2014,1838( 8) : 2115-2126．［ 15］ BOUWSTRAJA,PILGRIMK,PONECM．Structure of The SkinBarrier［M］．In: Elias PM,Feingold KR,eds．New York:Taylor and Francis,2006: 65-95．［ 16］ PROKSCHE,FEINGOLDKR,ELIASPM．Epidermal HMGCoA reductase activity in essential fatty acid deficiency: barrierrequirements rather than eicosanoid generation regulate cho-lesterolsynthesis［J］．J Invest Dermatol,1992,99( 2) : 216-220．

［ 17］ HERRMANNT,VANDERHOEVENF,GRONEHJ,et al．Mice with targeted disruption of the fatty acid transport protein 4( Fatp 4,Slc27a4) gene show features of lethal restrictive der-mopathy［J］．J Cell Biol,2003,161( 6) : 1105-1115．［ 18］ MANMQ,CHOIEH,SCHMUTHM,et al．Basis for improvedpermeability barrier homeostasis induced by PPARand LXRactivators: liposensors stimulate lipid synthesis,lamellar body secretion,and post-secretory lipid processing［J］．J Invest Dermatol,2006,126( 2) : 386-392．［ 19］ PROKSCHE,ELIASPM,FEINGOLDKR．Regulation of3-hydroxy-3-methy-lglutarylcoenzyme A reductase activity in murine epidermis,Modulation of enzyme content and activation state by barrier requirements［J］．J Clin Invest,1990,85( 3) : 874-882．［ 20 ］ KANSYM,SENNERF,GUBERNATORK．Physicochemical highthroughput screening: parallel artificial membrane permeation assayin the description of passive absorption processes［J］．J Med Chem,1998,41( 7) : 1007-1010．［ 21］ OTTAVIANIG,MARTELS,CARRUPTPA．Parallel artificialmembrane permeability assay: a new membrane for the fast prediction of passive human skin permeability ［J］．J Med Chem,2006,49( 13) : 3948-3954．［ 22 ］ KARADZOVSKAD,RIVIEREJE．Assessing vehicle effects onskin absorption using artificial membrane［J］．Eur J Pharm Sci,2013,50( 5) : 569-576．［ 23］ TSINMANK,SINKB．A high throughput method to predictskin penetration and screen topical formulations［J］．Cosmet Toiletries,2013,128( 3) : 192-199．［ 24 ］ FLATENGE,DHANIKULAAB,LUTHMANK,et al．Drugpermeability across a phospholipid vesicle based barrier: a novelapproach for studying passive diffusion［J］．Eur J Pharm Sci,2006,27( 1) : 80-90．［ 25］ FLATENGE,BUNJESH,LUTHMANK,et al．Drug permeability across a phospholipid vesicle-based barrier 2．Characterization of barrier structure,storage stability and stability towards pHchanges［J］.Eur J Pharm Sci,2006,28( 4) : 336-343．［ 26］ FLATENGE,SKARM,LUTHMANK,et al． Drug permeability across a phospholipid vesicle based barrier: 3．Characterizationof drug-membrane interactions and the effect of agitation on thebarrier integrity and on the permeability［J］．Eur J Pharm Sci,2007,30( 3-4) : 324-332．［ 27 ］ PALACZ,ENGESLANDA,FLATENGE,et al．Liposomes for( trans) dermal drug del-ivery: the skin-PVPA as a novel in vitrostratum corneum model in formulation development［J］．J Liposome Res,2014,24( 4) : 313-322．［ 28 ］ ENGESLANDA,KALKO-BASNETN,FLATENGE.PVPAand EpiSkin in assessment of drug therapies destined for skinadministration［J］．J Pharm Sci,2015,104( 3) : 1119-1127．

［29 ］ BAIY,DULN,FENGX,et al．Progress of transdermal drug delivery systems for natural drugs［J］．Chin Pharm J (中国药学杂志) ,2014,49( 16) : 1377-1381．［ 30 ］ GUOT,ZHANGYT,ZHAOJH,et al．Application of lipidcarriers combining micro-needle in transdermal drug delivery［J］．Chin Pharm J (中国药学杂志) ,2015,50( 13) : 10-85-1089．［ 31 ］ LIC,HUJH.Analysis of pharmacokinetic characteristics of lowmolecular weight heparin gel after transdermal adminstration by invivo microdialysis technique combined with colorimetric methods［J］．Chin Pharm J (中国药学杂志),2015,50 ( 21 ) : 1899-1904．［ 32 ］ ZUQ,DILQ ,ZHAOXL,et al．Comparison of skin for percutaneous permeability of Xuetie Dingchuan Plaster in vitro［J］ ．Chin Tradit Herb Drugs(中草药) ,2007,38( 4) : 519-521．［ 33 ］ SHENSG,ZHAOJ,LIH,et al．Comparison of permeation barrier in the study of percu-taneous absorption of nimodipine［J］．JHebei Univ(河北大学学报) ,2005,25( 2) : 157-160．

［ 34 ］ FLATENGE,AWOYEMIO,LUTHMANK,et al． The phospholipid vesicle-based drug permeability assay: 5．Development toward an automated procedure for high-throughputper-meabilityscreening［J］．J Laboratory Automation,2009,14( 1) : 12-21．

3. 设计方案和技术路线

1、磷脂材料的筛选

2、磷脂用量的筛选

3、制备脂质人工皮肤膜

4. 工作计划

已完成磷脂材料和磷脂用量的筛选，正在完成脂质人工皮肤膜的质量可控研究。

5. 难点与创新点

采用新型复合磷脂脂质体技术，能够模拟人皮肤，相关性达99%以上，这种新型体外人工皮肤模型，能替代动物实验，对经皮给药制剂的研究具有深远意义，同时满足国际呼声日益升高的动物伦理理念，紧跟国际步伐。

您可能感兴趣的文章

• NLRP3炎症小体活化在PDGF-RhoGDI3信号介导VSMC表型转化中的作用开题报告
• 咪达那新的有关物质研究开题报告
• 注射用阿奇霉素（0.5g）有关物质方法学开题报告
• 多西他赛聚合物胶束的制备开题报告
• 聚乙二醇-聚赖氨酸胶束的制备与评价开题报告
• 光敏性氧化锌壳聚糖纳米粒的制备与抑菌研究开题报告
• 通塞颗粒含量测定研究开题报告
• 硫酸舒欣啶含量测定研究开题报告
• 硝酸甘油注射液含量测定研究开题报告
• 马来酸氯苯那敏注射液含量测定研究开题报告