1. 研究目的与意义
H168（2，5-二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪)，是课题组经多年研究筛选得到的正性肌力活性化合物。根据心血管专家 Larissa等报道，H168作用于心肌细胞上的SERCA 2a 靶点，该靶点因其高安全性和适用性，将是心力衰竭药物的理想靶点。目前尚未有基于该靶点的药物上市。前期研究表明H168水溶性好，半衰期较短，作用快，适合制成注射液，用于临床治疗急性心衰。目前，作为急救用药的注射液已进入临床前研究阶段。
内容：本次毕业设计将在H168的理化性质及注射液的小试工艺及质量研究的基础上进行工艺放大研究，包括原辅料和容器的前处理、称量、配制、过滤、灌封、灭菌、质量检查、包装等。
意义：本课题研究将为申报临床批件提供中试研究资料，为申报新药奠定基础。
2. 文献综述
小针注射液生产工艺的研究进展
12药物制剂1班 高苏林 048012124
摘要:伴随人口老龄化进程的加快，心力衰竭等疾病的患病率也在持续升高。目前市场上已有的强心类药物存在着严重的不良反应。因此，寻求更加安全有效的药物迫在眉睫。H168是课题组经多年努力，最终筛选得到的用于治疗心力衰竭的新型化合物。该化合物能作用于心肌细胞肌浆网上的SERCA 2a 靶点[1]，从而起到促进心肌细胞Ca2 循环，增强心肌收缩力的作用，因此也避开了已有药物易致心律失常的副作用。同时其水溶性好，半衰期短决定H168适宜制成注射液。
关键词:H168；注射液；生产工艺
心力衰竭是高血压病、冠状动脉性心脑病与风湿性心脏病等心脏疾病导致的心功能不全的一种综合征，是各种心脏病发展的严重阶段，严重影响着人类健康。目前，通过口服正性肌力药物来改善心肌收缩功能是慢性心衰重要的药物治疗方法。但是常用的如正性肌力药物磷酸二酯酶(PDE)Ⅲ抑制剂米力农、Na /K -ATP 酶抑制剂地高辛和洋地黄毒苷等，都有导致心律失常的不良反应，安全性较低。化学名称2，5-二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪(H168)，是课题组经过多年研究筛选得到的一个正性肌力活性化合物。心血管系统专家Larissa Lipskaia 教授预测，由于其安全性和适用性，SERCA 2a 靶点是治疗心力衰竭的最理想靶点[2]，目前尚未有基于该靶点的药物上市。H168 作用于心肌细胞上的SERCA 2a 靶点，靶标新颖，正性肌力作用显著，无现有正性肌力药物常见的心律失常副作用，无致畸胎、致突变，无急性毒性，无局部毒性，具有很高的安全性，已受到美国与中国专利授权[3-4]。目前，作为急救用药的注射液已进入临床前研究阶段。
前期研究表明H168 水溶性好，半衰期较短，作用快，适合制成注射液，用于临床治疗急性心衰[5]。注射剂一般生产过程包括：原辅料和容器的前处理、称量、配制、过滤、灌封、灭菌、质量检查、包装等步骤。
1.注射液容器及前处理注射液用的玻璃容器或塑料容器(安瓿/西林小瓶)均应符合国家有关注射用容器的标准规定。
1.1安瓿的洗涤安瓿属于二类药包材，洗涤用水应是新鲜注射用水。
洗涤方法：甩水洗涤法、加压气水喷射洗涤法和超声洗涤法。
超声洗涤法是采用超声波洗涤与气水喷射式洗涤相结合的方法，具清洗洁净度高、速度快等特点。1.2安瓿的干燥或灭菌①小量生产时，用新鲜的注射用水洗净后，可以直接灌装药液，但要控制余水，保证药液的浓度。一般安瓿洗净后要在烘箱内120-140℃温度下进行干燥，若用于无菌操作或低温灭菌的安瓿还需180℃干热灭菌1.5小时。
②大量生产必须进行干燥，多采用隧道式干热灭菌机，以避免存放时滋长微生物。
③干燥或灭菌操作时，均应避免空气中微粒的污染，可配备局部层流装置以保持空气的洁净。
④灭菌后的安瓿存放柜应有净化空气保护，安瓿存放时间不应超过24小时。2.注射液的配制2.1原辅料的准备与投料供注射液生产所用原料必须达到注射用规格，符合《中国药典》及国家有关对注射液原料质量标准的要求。辅料也应符合《中国药典》或国家其他有关质量标准，若有注射用规格，应选用注射用规格。初步拟定注射剂规格120mg，2ml,因此至少需要120g(1000支）。
2.2配制用具的选择与处理配液用具和容器的材料不宜采用铝、铁、铜制器具。大量生产时常用不锈钢夹层配液罐，既可通蒸汽加热，又可通冷水冷却。
2.3注射液的配制配液方法有两种：稀配法和浓配法。
对于不易滤清的药液，可加注射用活性炭处理，其有吸附、助滤和脱色等作用。对于热原在注射液工艺生产中也常采用活性炭吸附去除, 活性炭吸附作用对小剂量的药物其含量影响较大。另外, 活性炭在酸性药物中吸附作用较强, 在碱性药物中有时出现胶溶或脱吸附作用, 反使溶液的杂质增加[6]。近期发展起来一种超滤工艺用于去除热原,也收到良好效果。超过滤是以压力差为推动力的膜分离过程, 此项技术广泛用于微粒的脱除, 包括细菌、病毒、热原和其它异物的去除。尤其部分对热敏感的药物, 可采用超滤配合无菌操作工艺去除热原和微生物, 从而达到保证产品质量的目的[7]。
3.注射液的滤过滤过是保证注射液澄明的关键工序。由于不同滤器的滤过性能不同，故应根据具体情况合理选择，才能达到最佳效果。
3.1注射液生产中常用的滤器
(1)垂熔玻璃滤器：化学性质稳定，吸附性低，一般不影响药液的pH；主要用于精滤或膜滤前的预滤；每次使用前要用纯化水反复冲洗，并于1%-2%硝酸钠硫酸溶液中浸泡12-24小时。
(2)微孔滤膜滤器：孔径小，孔隙率高，截留能力强，滤速快，不影响药液的pH，不滞留药液。缺点是易于堵塞。常用于精滤和过滤除菌（0.22mm）。使用前应进行膜与药物溶液的配伍试验，确认无相互影响才能选用。常用的是由醋酸、硝酸纤维素混合酯组成的微孔滤膜。
(3)钛滤器：包括钛滤棒和钛滤片；常用于注射液的预滤。
(4)板框压滤机：滤过面积大，截留固体多，经济耐用，适于大生产，常用于滤过黏性、微粒较大的浸出液。也可用于注射液的粗滤。
(5)砂滤棒：一般用于注射液的粗滤。
3.2滤过方法一般采用预滤与精滤相结合：（如板框压滤机→垂熔玻璃滤球→微孔膜滤器）
根据滤过的动力压差，可采用高位静压滤过、减压滤过或加压滤过。
表1滤过方法
高位静压滤过装置 | 减压滤过装置 | 加压滤过装置 |
压力稳定，滤过质量好，但流速稍慢 | 滤过速度快，但压力不够稳定，滤层易松动，影响质量 | 滤过速度快，压力稳定，质量好 |
注射液生产中滤过多采用高位静压滤过或加压滤过。
4.注射液的灌封
灌封是注射液生产中非常关键的操作，安瓿中注射液的实际灌注量应等于标示量加上附加量。《中国药典》对注射剂附加量有明确规定。
表2药典关于标示量及附加量的规定
标示装量/ml | 增加量/ml | |
易流动液 | 粘稠液 | |
0.5 | 0.10 | 0.12 |
1 | 0.10 | 0.15 |
2 | 0.15 | 0.25 |
5 | 0.30 | 0.50 |
10 | 0.50 | 0.70 |
20 | 0.60 | 0.90 |
50 | 1.00 | 1.50 |
安瓿熔封方法分为拉封和顶封两种，由于拉封封口严密，颈端圆整光滑，所以目前规定必须用拉封封口，即拉丝封口。
4.1灌封包括手动灌封和机械灌封
对于机械灌封，药品生产企业多采用全自动灌封机。机械灌封时，自动灌注药液后立即进行熔封，在同一台机器上完成。灌注药液均由下列动作协调进行：安瓿传送至轨道，灌注针头下降，药液灌装并充气、封口、再由轨道送出产品。灌液部分装有自动止灌装置，当灌注针头降下无安瓿时，药液不在输出，避免污染及其与浪费。罐封室是注射液制备的关键区域，洁净度要求达到100级。5.注射液的灭菌和检漏5.1注射液的灭菌
最终灭菌小容量注射液是在药液灌装时完成灭菌的[8]。注射液从配液到灭菌一般须在12小时内完成，注射剂制备中常用湿热灭菌法包括热压灭菌和流通蒸汽灭菌法。各种微生物对湿热的抵抗力不同，细菌孢子较细菌对湿热的耐受力更强。然而，在一个大气压下，水温最高只可达100 ℃，除非用很长时间，否则很难将细菌孢子杀灭。如欲使湿热的温度提高到100 ℃以上，则需采用热压方法。热压灭菌的压力越高，所需时间越短。注射剂灭菌通常采用的灭菌条件为121 ℃15 min或115 ℃30 min。注射剂灭菌也可采用其他温度和时间参数，但必须保证制剂灭菌后的SAL≥10-6[9]。
5.2注射液的检漏最终灭菌的注射液在生产过程中会采用检漏灭菌一体化的仪器进行安瓿的灭菌和检漏操作。在检漏过程中都应避免由于检漏过程而造成的二次污染，《药品生产质量管理规范(2010年修订)》也明确检漏用的介质至少应为纯化水，但在技术不断发展的今天，可以考虑使用高压电检漏或，这两种方式既能达到检漏目的又能避免检漏用水对产品的二次污染。同时，逐支真空检漏这一方式也得到欧盟、FDA的确认，只是目前国内以食品行业使用该类设备较多，在制药行业尚未得到较多的关注[8]。
6.注射液的质量检查制备的注射液必须经过质量检查，每种注射液均有具体规定，需符合《中国药典》现行版注射液项下的各项规定，包括装量、pH 值、渗透压摩尔浓度、可见异物、不溶性微粒、热源、无菌等检查。
6.1无菌
避免人员污染、除菌过滤和净化空调系统，三大要素相辅相成，是无菌保证的重要基础。欧美及WHOGMP 无菌药品指导原则中指出：可能时，在灌装前对注射液的药液进行过滤除菌，目的是消除药液被耐热芽胞污染导致的难以彻底灭菌的不利因素[10]。无菌保证的注意事项[10]：
（1）在确定灭菌工艺之前，首先要对工艺进行深入的研究，以提高产品的耐热性。例如，通过严格控制药液中氧的含量，从注射用水充氮保护开始，在产品密封前工艺的各个环节进行充氮保护，小容量注射液可以采用残存概率法或无菌制造工艺，并在无菌制造工艺后适度灭菌（辅以流通蒸汽灭菌法等），提高产品的无菌保证水平。
（2）采用无菌制造工艺，与产品直接接触的容器、橡塞、与配制和灌装相关的储罐、管路、缓冲罐、灌装用具等均应灭菌；灌装前药液进行有效的除菌过滤；注意保持净化空调系统的连续正常运行，以防止气源性芽孢的污染；建立适当的动态环境标准，每批产品的生产过程中，均需对配制及灌装区的环境进行监控，超出标准限度的微生物应进行镜检，检查是否存在芽孢；建立产品灭菌前药液微生物污染水平的内控标准，监测每批产品灭菌前药液的微生物污染水平及污染菌的耐热性；例如，可将该批灌装开始、中间及结束时的产品各取一瓶，采用过滤法检查药液的微生物污染水平，将从药液中分离得到的污染菌置于80℃水浴下10～15 分钟后作无菌检查，确定是否有耐热微生物，如果存在耐热微生物，产品应作报废处理；定期进行培养基灌装验证，证明经过完整的生产过程，产品污染率不超过0.1%。对耐热的注射液，在没有监控主辅料、容器设备和环境微生物污染水平的情况下，选择流通蒸汽灭菌法。或者，对耐热的注射液，即使选择湿热灭菌的方式，但灭菌工艺的F0较低，不能保证产品达到无菌要求。
（3）产品灭菌前的微生物污染来自原辅料、内包装材料、配制与灌装工艺设备、生产操作，以及生产环境等；采用无菌制造工艺生产的注射液产品，与产品直接接触的容器、橡塞、与配制和灌装相关的储罐、管路、缓冲罐、灌装用具不能有效灭菌，灌装前药液不能进行有效的除菌过滤，以及灌装环境层流保护不够等。
6.2热原
张亚楠等[11]通过实验表明活性炭对于去除热原确实有效，但大剂量细菌内毒素污染的情况下不能彻底去除。活性炭可有效吸附去除注射液中热原，药液中吸附率大于70％。说明针剂在制造过程中加入活性炭吸附大量热原(细菌内毒素)科学合理的。但实验结果也表明，对于大剂量的细菌内毒素，活性炭不能完全吸附去除。因此在注射液制造工艺中采用活性炭除热原，应对制造工艺的风险进行合理评估，以确保最终产品中热原符合标准，保证药品临床的安全应用。同时在试验中所采用规格的超滤膜可完全滤除热原。采用超滤膜去除注射液中的细菌内毒素均能达到log 值大于3，可有效的保证最终产品中热原残留达到要求。
7.总结
根据康璧[12]等研究发现H168水溶性好，120mg.ml-1的溶液pH值在8.0左右，符合注射液的pH值规定范围，处方简单，便于生产，对于注射剂中试工艺，可以考虑采用超滤法替换活性炭除热原，对于残留色素等依旧可以用少量活性炭吸附除去，具体的工艺条件还需要通过实践进一步摸索。
参考文献
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3. 设计方案和技术路线
研究方案：
1.查阅文献，了解H168理化性质及注射剂的制备工艺；
2.实验材料准备：原料药及相关的制药设备；
4. 工作计划
2015.12～2016.01：查阅相关资料设计中试工艺流程实验方案；
2016.03～2016.04：重复小试工艺并进行中试工艺放大；
2016.05～2016.06：进行样品质量检验、稳定性试验并撰写毕业论文。
5. 难点与创新点
1.目前尚未有基于该靶点的药物上市。H168水溶性好，半衰期较短，作用快，适合制成注射液，H168注射液在生产制备工艺上的探索少之又少。
2.即使前期进行小试工艺条件的摸索，但是中试工艺由于批量的改变将会遇到许多不可预测的问题。
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