1. 研究目的与意义
内容：
从1957年，Alder和Wainwright完成了首次模拟开始，作为一项结合了数学、物理、化学及生物学等科学的前沿技术，分子动力学模拟（moleculardynamicsimulation,MD）在诞生至今的几十年中不断发展完善，已成为应用最为广泛的分子模拟方法之一。特别在最近十年中，伴随着计算机科学技术的进步，计算能力突飞猛进，分子动力学模拟也开始在多个领域展现其强大的能力。尤其是在生物大分子领域，分子动力学模拟越来越体现出其速度快、与实验结果吻合度高的优越性。2013年诺贝尔化学奖，更是授予了分子动力学模拟开拓者之一的MartinKarplus先生。分子动力学最重要的特性之一就是可以观察体系随时间演变的过程，随着计算机水平的提升，分子动力学目前已经可以达到毫秒级（ms）的时间尺度。
本课题将借助分子模拟软件DiscoveryStudio4.0（简称DS）中分子动力学组件（基于CHARMm立场）来研究低氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α）与pVHL的相互作用。
2. 文献综述
文献综述：
分子动力学研究HIF-1α/pVHL相互作用
黄琼斌
南京中医药大学翰林学院药学1202班
摘要：HIF-1α是一种转录因子，它与神经系统损伤、肺动脉高压、肿瘤等疾病密切相关。HIF-1α对缺氧具有特异敏感性。HIF-1α/pVHL蛋白-蛋白相互作用天然产物的研究，对改善心肌缺血、减少缺血再灌注损伤、肺动脉高压形成、缺血性脑血管病及肿瘤相关疾病等方面具有深远的意义。运用分子动力学模拟研究蛋白与蛋白的分子识别机制、识别模型的建立以及分子识别与分子选择性关系，不仅对揭示生物学本质具有非常重要的意义，而且还可以应用于指导设计和合成具有特殊识别功能和生物活性的化合物。
关键词：HIF-1α；pVHL；分子动力学；
1HIF-1α与pVHL的概述
低氧诱导因子-1（hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1）是1992年由Semenza等在缺氧诱导Hep3B细胞核提取物中发现的一种氧依赖转录激活因子，是低氧适应和病理反应中的一个特异的中介因子。HIF-1通过与缺氧反应应答元件（HRE）结合，促进下游靶基因转录，使机体产生一系列低氧适应反应。目前已知受HIF-1调控的基因有60余种1。
VHL基因得名于VHL病，VHL基因是一个抑癌基因，位于染色体3P25-26区，该基因的失活会导致正常的VHL蛋白合成障碍。VHLmRNA编码两种不同的蛋白质，pVHL30和pVHLl9，分子量分别为30kD和19kD，各由213个氨基酸和180个氨基酸组成，pVHLl9是在VHL基因的第二转录起始位点(54号密码子)上转录形成的，pVHL30和pVHLl9的不同之处在于前者有8个氨基酸末端重复的存在。
1.1HIF-1α与VHL的结构
HIF-1主要以异源二聚体的形式存在，由诱导型α亚基（HIF-1α）和组织型β（HIF-1β）亚基组成。b亚单位是ARNT蛋白质家族的一员,ARNT家族包括ARNT(HIF-1β)，ARNT2,ARNT3。b亚单位其蛋白质含量没有显著受到缺氧的影响。A亚单位是一种蛋白质家族的组成成分,包括HIF-1α,HIF-2α(HLFEPAS-1,MOP2),和HIF-3α(3-7)。对于HIF-1α,最广泛研究驻留在氨基酸531-575之间和775-826(3、8、9)。2
HIF-1α为HIF-1所特有，它既是HIF-1的调节亚基又是活性亚基，其蛋白稳定性和转录活性均受细胞内氧浓度的调节。因此，HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1α亚基的活性和表达3。
VHL是E3复合体的一个重要组成成分,E3复合体还包括elonginB,elonginC、Cul2,Rbx1(22-26)。VHL蛋白的二级结构由位于N-末端7个β折叠和C-末端的4个α螺旋构成。其中3个α螺旋位于蛋白的一侧，构成了α区；另外4个β折叠和1个α螺旋位于一侧，构成了β区。这两个区域包含不同的蛋白结合位点：α区可以与转录延长因子B、C(ElonginB、C)复合物相连接，β区可以与缺氧诱导因子lα(HIF-1α)等底物分子相连接，这两个区域的完整对VHL蛋白的功能有重要意义。
图1HIF-1α及pVHL结构
1.2机制
在正常氧含量条件下HIF中α亚基上的脯氨酸残基会透过HIF脯氨酰羟化酶羟基化，而使其能被VHLE3泛素连接酶辨识并泛素化，之后透过蛋白酶体4使其被快速降解。但在缺氧条件下，HIF脯氨酰羟化酶会被抑制，HIF-1α不能被降解，导致在细胞内的蓄积，并进入细胞核与HIF-1β亚基形成异二聚复合体，后者可与其靶基因的低氧反应元件(HRE)中的核心序列5-RCGTG-3(R表示嘌呤)相结合，在靶基因的转录起始部位形成一个转录起始复合物，从而启动靶基因的转录，引起相应的病理生理反应。
图2HIF-1α及pVHL相互作用机制
2研究HIF-1α/VHL蛋白-蛋白相互作用天然产物的意义
2.1对脑损伤的意义
HIF-1α可调控多种低氧反应基因的转录，参与低氧反应信号转导过程。作为转录调节因子，在缺血性脑血管病中的神经保护作用，主要通过调节其下游靶基因及其产物的表达来发挥作用的。目前公认的HIF-1结合位点序列为5-(G/C/T)ACGTGC(G/C)-3，或5'-RCGTG-3'。HIF-1α与该位点结合后，激活TAD-C结构域，诱导P300/CBP入核，并与HIF-1和其他转录因子结合，形成转录起始复合物，从而启动下游靶基因的表达转录。
HIF-1α的靶基因分布广泛，有研究报道5，HIF-1至少能诱导数百个靶基因的表达。HIF-1α激活后可转录调节下游多种基因，而这些基因的蛋白产物涉及血管生成、能量代谢、红细胞生成、血管舒缩反应、细胞增殖和存活以及血管重塑、葡萄糖利用和促进糖酵解等方面具有重要的作用，以保持机体的氧稳态。轻度缺氧时，HIF-1产生缺氧耐受性，发挥神经保护作用，长期重度缺氧时，诱导神经细胞凋亡，具有神经毒性作用。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfractor,VEGF)就是HIF-1α的众多靶基因中的一个。VEGF在肿瘤血管形成过程中起关键作用。研究表明：在缺氧时调节VEGF的信号传导途径中，HIF-1α起中枢纽带作用，它的功能不仅使VEGF的mRNA稳定性增加，而且能增加VEGF的转录活性。目前认为，VEGF对血管发育的调节主要是通过Flk-1、Flt-1和NRP1激活内皮细胞内PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路，进而促进内皮细胞增殖、迁移和新生血管形成。VEGF保护神经细胞免于双链损伤6，抑制缺血脑内Caspase-3的活化7，促进细胞存活8。
2.2对肿瘤的意义
HIF-1α过量表达可作为肿瘤侵袭性强的一个标志，提示其早期死亡危险性高。大量实验研究表明，抑癌基因的突变或抑制可以明显提高HIF-1α在肿瘤缺氧环境中的表达。Semenza等发现VHL抑癌基因的缺失可直接导致肾癌细胞系中HIF-1α的过表达。9
2.3对缺血性心脏疾病的意义
大量研究发现HIF-1α同时也参与了心肌缺血预处理的保护作用。牛铁生等11驯通过研究缺血预适应对急性心肌梗死HIF-1α表达变化的影响认为，HIF-1α参与了缺血预处理的心肌保护作用，并可能是内源性保护机制的始动因子。
2.4对炎症的意义
微环境的低氧是炎症组织重要的病理特征。HIF-1α缺氧感受途径通过不同的机制在不同的环节直接或间接参与了对免疫反应的调控，并且在此过程中发挥了重要的作用。Ding等12实验证明HIF-1α和VGEF共同参与慢性阻塞性肺疾病的发生、发展过程，在肺内炎症微环境中呈阳性表达，并且呈正相关。Zinkernagel等13也发现HIF-1α不仅调控巨噬细胞的免疫相关基因，也调控CD4 和CD8 T细胞介导的炎症细胞因子的产生，但与巨噬细胞和中性粒细胞相比小得多。HIF-1α调节i-NOS表达升高后产生的NO可促进髓系细胞TNF-α的释放，从而放大炎性反应。在感染局部，这些炎性介质进一步促进细胞内的HIF-1α蛋白水平增加，活性增强14。
3分子动力学模拟
分子动力学模拟方法作为应用最广泛的分子模拟方法，是具有确定性的模拟方法，其通过求解一组原子运动方程得到整个体系的相空间运动轨迹，再利用统计学方法得到其宏观性质。因此，分子动力学计算能够得出体系宏观物理性质随时间的变化情况。目前，用于对生物大分子体系进行分子力学和分子动力学模拟的软件主要有Gromacs，DiscoveryStudio，Amber，NAMD，CHARMM等15。随着大规模并行计算机的发展和更为完善的计算方法的出现，可以预期分子模拟技术在蛋白领域将有更加广阔的应用发展。
3.1分子动力学模拟优点
由于实验设备、实验技术、实验样品准备、实验周期及实验成本等的限制，传统生物物理学方法难以在普通的实验室得到普及16。而随着计算机技术的发展，计算科学在科学研究中占据越来越重要的地位，分子动力学模拟(moleculardynamicssimulation，MDS)作为计算科学的重要研究手段之一，以其可以同时提供高空间分辨率微观结构信息及高时间分辨率结构动力学信息的独特优势，在生物大分子微观结构动力学研究中发挥着重要作用17。目前，MDS与实验手段相结合，在生物大分子结构功能关系研究中得到越来越广泛的应用。
3.2分子动力学基本原理及流程
分子动力学模拟方法的基本原理是，以原子为基本元素，以牛顿第二定律为控制方程，在经验势场作用下，采用计算机模拟由多个原子组成的分子体系随时间变化的动态演化过程18。其基本工作流程如下：首先是模拟系统的构建，主要包括目标分子初始原子坐标和模拟系统环境构建两部分。前者主要通过蛋白质数据库(ProteinDataBank，PDB)获得，对于蛋白质数据库中尚未报道的结构，也可通过同源模建、分子对接等模拟手段获得其初始结构；后者则根据目标分子的生物学特征构建相应水环境、离子环境和质膜环境等，以期尽可能模拟生理环境。能量最小化是优化模拟系统的重要过程，共轭梯度和最陡下降算法是能量最小化的常用算法，其目的是降低系统构建过程中产生的不合理构象，并且使系统能量达到极小或最小；然后经过系统升温，进行分子动力学模拟的主要模拟过程平衡模拟，该过程是考察目标分子微观结构特征及其结构稳定性的主要模拟过程，同时也是进行后续调控模拟的必要过程，最后进行采样分析19。
4.结语
本文综述了HIF-1α/pVHL蛋白-蛋白相互作用的机制及研究意义，由于国内外对其的报道还不太全面，所以通过运用分子动力学模拟软件来对其研究，这对研究蛋白与蛋白相互作用关系起到一定的辅助作用，借助计算机模拟的方法来分析蛋白-蛋白相互作用情况，将对我们研究蛋白-蛋白作用带来更高的准确性和更高的效率。
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3. 设计方案和技术路线
研究方案：分子动力学模拟主要分为四个步骤：第一是蛋白质分子的最优化预处理，第二是热力学与动力学平衡过程（equilibration），第三是采样过程（productionrun），第四是将计算结果进行分析。 技术路线： |
4. 工作计划
2022.1~2022.2：文献查阅及整理，阅读相关资料，做好实验前期准备工作
2022.3~2022.4:基于电脑模拟软件
2022.4~2022.5:验证，并完成论文
5. 难点与创新点
本课题将采用DS软件模拟组件来研究HIF-1α/pVHL蛋白-蛋白相互作用，这对研究蛋白与蛋白相互作用关系起到一定辅助作用。借助计算机模拟的方法来分析蛋白-蛋白相互作用情况，将对我们研究蛋白-蛋白作用抑制剂带来更高的准确性和更高的效率。运用分子动力学方法来研究蛋白与蛋白相互作用可以使我们更加方便快捷的了解HIF-1α/pVHL的相互作用机制。
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