1. 研究目的与意义
内容：采用基于16S rDNA基因的 Hiseq 测序技术，探讨给予甘遂各样品对正常动物肠道菌群结构的影响，构建给予甘遂各样品的正常动物肠道菌群结构多样性指纹谱（菌群结构信息），并采用UniFrac及PCA等多元统计方法研究给予甘遂各样品前后正常动物肠道菌群结构的差异，阐释甘遂各样品作用于正常动物肠道菌群结构变化的内涵。
意义：泻下中药甘遂为峻下之品，有毒，中医临床采用醋炙以降低其毒性，综合文献和本课题组成员前期研究表明：甘遂毒性作用部位与胃肠道密切相关。因此，选用正常动物，应用基因测序技术、多变量的数据统计与挖掘技术，探寻与甘遂毒性高度相关的肠道菌群结构，并比较甘遂不同活性成分（群）的作用差异，为研究甘遂醋炙减毒的生物学作用和物质基础提供一定的依据。
2. 文献综述
甘遂毒性研究进展及基因测序技术在医药领域的应用
摘要 查阅近几年有关甘遂毒性研究的文献，综述其毒性物质基础与毒性机制。近年来基因测序技术取得了较快发展，逐步应用到医药领域研究的各个阶段，这为甘遂毒性研究深入到分子生物学水平提供了新思路。本文主要介绍了甘遂毒性研究进展、基因测序技术的发展及其在医药领域的应用，为后期对甘遂的深入研究提供参考。
关键词 甘遂；毒性；基因测序技术
Research Progress on Toxicity of Euphorbia kansui and Applications of Gene Sequencing Technology on Medicine
Abstract Summary the research results of toxic components and toxicity mechanism about Euphorbia kansui, after consulting related literatures of its gastrointestinal toxicity in recent years. The DNA sequencing technology has obtained rapid development and applied every stage of medicine, which provided a new idea to research Euphorbia kansui at the level of molecular biology. The thesis mainly studies the research progress on toxicity of Euphorbia kansui and the development of gene sequencing technology, and introduces the applications on medicine, which provides references for the further study of Euphorbia kansui.
Key words Euphorbia kansui; Toxicity; Gene sequencing technology
甘遂为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T. N. Liou ex T. P. Wang的干燥块根，始载于《神农本草经》，列为下品，其性味苦寒，有毒。现代毒性研究表明，甘遂毒性强烈，稍过量即可产生强烈腹痛、腹泻、神经麻痹等一系列中毒症状，甚至严重威胁生命安全[1]。文献研究表明，甘遂的毒效部位均在胃肠部位，但作用机制尚未能清晰揭示。近年来，采用基因测序技术进行肠道菌研究以揭示中药作用机制的方法方兴未艾。因此，本文拟从甘遂的毒性研究进展及测序技术等角度对近年文献进行综述，以期为揭示甘遂毒性作用机制提供思路。
1甘遂毒性研究进展
从甘遂的95%乙醇提取物中分离得到的kansuinine B、kansuinine A和3-O-(20E,40Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇是诱导小鼠淋巴细胞(SPL)和大鼠腹腔巨噬细胞(PMφ)致炎、产生刺激性的主要成分，推测可能是通过促进小鼠淋巴细胞增值和促进大鼠腹腔巨噬细胞NO生产量的增加而实现的[2]。从甘遂的乙酸乙酯提取物中分离得到的3-O-(2′E,4′Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇和Kansenone能够诱导大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)的调亡，通过增加细胞内活性氧ROS生成，扰乱线粒体膜电位，诱导细胞色素C从线粒体向胞质释放，提高促凋亡蛋白Bax，AIF和Apaf-1的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，激活caspase-3，8，9这一系列线粒体途径诱导细胞凋亡[3-4]。张丽[5]等发现，甘遂主要毒性成分为巨大戟烷型二萜类化合物和含有8-烯-7-酮结构的三萜类化合物。这些化合物对人体正常细胞系L-O2和GES-1都显示较强的细胞毒性。由于甘遂巨大戟二萜类化合物的强烈刺激性作用，Zhou Yang[6]等用代谢组学的方法研究甘遂急性毒性机制。Wistar大鼠给予高剂量的甘遂乙酸乙酯提取液，在结肠和直肠的血浆中发现了结肠源性尿毒症标志物苯酚硫酸盐、吲哚酚硫酸盐和对甲酚硫酸盐。推测甘遂中引起结肠源性尿毒症标志物的化合物可能诱导急性毒性的发生。唐冰雯[7-8]等运用正交最小二乘判别(orthogonal partial leastsquares-discriminant analysis，OPLS-DA) 方法进行甘遂毒性的血浆代谢组学研究，发现甘遂可引起机体能量代谢、氨基酸代谢和脂代谢紊乱。景欣悦[9]等研究甘遂与甘草合用对甘遂中毒性成分甘遂萜酯A (Kansuinine A，KA) 和甘遂萜酯B (Kansuinine B，KB)代谢的影响。发现CYP2C19 均可能参与了甘遂毒性成分KA、KB 的代谢，甘遂与甘草合用能够抑制CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2 及CYP2C19 的活性，而使KA、KB 的代谢减慢，产生蓄积。另外，甘草中主要成分甘草酸和甘草次酸能够抑制KA、KB 的代谢，这可能是甘遂与甘草合用毒性增加的原因之一。
2基因测序技术发展及其应用
2.1第一代测序技术
1977年，Maxam和Gilbert利用化学降解法测定了DNA顺序[10]。同年，Sanger和Coulson发明了加减法测定DNA序列。1977年，Sanger在测序体系中加入2＇,3＇-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），形成双脱氧链终止法，使得DNA测序效率和准确性大大提高[11]。Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术[12]，该技术可以达到很高的自动化程度，在人类和重要生物的全基因测序中发挥了重要作用。
这些技术统称为第一代测序技术，第一代测序技术曾在现代分子生物学研究中有过重要作用[13]。但其测序中的电泳过程限制其测序效率，通量较低，成本较高不适合大规模测序，而且在微量化等方面具有一定的局限性，因此逐步被第二代测序技术取代。
2.2第二代测序技术
近几年高通量测序技术相继涌现与发展，为大规模测序提供了技术支持。高通量测序平台主要包括Roche公司454焦磷酸测序、Illumina公司Solexa聚合酶合成测序及ABI公司SOLID连接酶测序，其特点在于运行数据量大，可以同时对数百万个DNA分子实施序列检测。
2.2.1 454测序技术
454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台Genome Sequencer 20，并成功对支原体Mycoplasma genitalium的基因组进行测序。2007年，454公司被Roche公司收购，并推出性能更优的第二代基因组测序平台Genome Sequencer FLX System(FLX)，接着公布了DNA双螺旋的发现者之一沃森Watson的个人基因组[14]，测序总花费不到一百万美元。其测序原理可简单概括为：将四种碱基T、A、G、C放置在四个单独的试剂瓶中，按顺序依次循环进入放有待测DNA片段的PTP板，当碱基配对时便释放焦磷酸。这些焦磷酸在经一系列酶促反应后，释放出光信号，一次信号与一个碱基配对相对应，由此就可以准确确定待测模板的碱基序列。与其它第二代测序平台相比，454测序法的突出优势是较长的读长，虽然测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对于那些需要进行较长长度准确读取的应用，如从头测序等，它仍是最理想的选择。然而，由于454测序技术成本较高限制了其进一步普及，以及后来高性价比的Solexa测序技术带来的市场压力，罗氏公司从2013年开始正在逐步关闭454生命科学测序业务，专心致力于发展第三代测序技术，并表示将逐步淘汰454 测序仪。
2.2.2 Solexa测序技术
Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用合成测序 (Sequencing by Synthesis)的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序[15]。该技术广泛应用的测序平台为HiSeq2500、Miseq等。聚合酶合成测序技术基本原理为：先将待测DNA分子使用超声或氮气打断为小片段，两端加上接头，连接载体，构建单链DNA文库。然后利用有单链引物的芯片将DNA分子片段固定在芯片上扩增，形成单克隆DNA簇。最后加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板的DNA片段序列。Solexa合成测序技术读取的片段多，测序通量高，高度自动化，适合大量小片段DNA及RNA的测序[16-19]。其运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术，运用广泛[20]。但随反应次数增加其效率降低、信号减弱，且读长较短，从头测序困难。
2.2.3 SOLID测序技术
SOLID是ABI公司于2007年底推出的全新测序技术，与454和Solexa的合成测序不同，SOLID是通过连接反应进行测序[21]的。其基本原理是以四色荧光标记的8个碱基的八聚体单链荧光探针进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。一次测序包括五轮连接反应，每轮反应结束后记录荧光信号。该技术优点在于通过两个碱基对应一个荧光信号，这样每个碱基读取两次，从而减少原始数据错误，提供内在的校对功能，得到的原始碱基数据准确性较高，是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。特别是针对SNP的检测[22-25]，适合检测参考基因序列。但在三种测序技术中，该技术测序读长最短，且读取长度受反应次数限制。
表1对三种测序平台相关技术内容与特点进行了系统比较。
表1 三种测序平台比较[26]
公司 | Roche | Illumina | ABI |
技术原理 | 焦磷酸测序 | 边合成边测序 | 连接测序 |
优点 | 读取长度大， 重复序列少 | 高通量、低错误率、低成本 | 高通量、高准确度、易区分SNP |
缺点 | 通量较低，成本相对较高 | 读长较短致使从头测序困难 | 读长较短致使从头测序困难 |
适用 | 从头测序和宏基因测序，序列拼装 | 表观遗传学研究、RNA测序 | 高GC含量样品、基因组重测序、SNP检测 |
精确度 | Q20 | Q30 | Q40 |
平均读长 | 400bp | 100bp | 50bp |
通量 | 0.5G | 30G | 50G |
2.3 第二代测序技术在医药领域的应用
近年来，第二代测序技术愈加普及，广泛运用于各领域，如土壤[27-29]、医学[30-33]、植物学[34-37]等。在此着重介绍第二代测序技术在医药领域的应用，在第二代测序技术出现前，人体微生物只有少数群体通过一代测序技术被描述和鉴定，而且对其致病机理知之甚少。第二代测序技术的普及，将为该研究领域带来机遇：他能让人类更好地了解这些微生物及其代谢物，可追溯其来源、与人类基因的相互作用等，进而指导诊断、用药等。在以上第二代测序技术中，454测序技术由于其读长优势，Solexa测序技术由于其高通量、低成本而被广泛应用，下面主要介绍这两种测序技术的应用并单独介绍近几年其在中药研究中的应用。
2.3.1 454测序技术的应用
Cantacessi[38]等人运用基于16S rRNA的454焦磷酸测序技术测定了被肠道钩虫感染前后粪便微生物群落组成和相对丰度差异，结果表明钩虫感染可致使肠道微生物物种丰度略微增加，但观察群落结构和多样性以及个别种类细菌相对丰度无显著影响。Cooper[39]等人对97名儿童的粪便进行微生物群落分析并分为三组：未感染组、感染鞭虫组、同时感染鞭虫和蛔虫组，利用454测序技术分析发现未感染组和感染鞭虫组微生物群落在不同分类水平无显著差异，混合感染组相比另两组粪便微生物群落有变化。这表明人类感染鞭虫可能不影响粪便微生物群变化，但感染蛔虫可能干扰粪便微生物群落。虞结梅[40]等应用454高通量测序分析了腹泻与健康儿童粪便标本中的病毒性病原组成情况，并采用统计学方法分析了主要病毒性病原的种类与序列数量在两类标本中的差异，通过序列同源性比对分析,发现了潜在的五种新病毒序列。
2.3.2 Solexa测序技术的应用
Qin[41]等利用Solexa测序技术对345名中国人的肠道微生物样本进行测序，并开发了一种全新的称为宏基因组关联研究的方法，深入探讨了肠道微生物失调和Ⅱ型糖尿病的关系。魏晓[42]等选取16例肝硬化患者及20例正常人，提取其肠道微生物宏基因组DNA进行高通量Solexa测序，分析比较肝硬化患者与正常人之间的差异，结果表明肝硬化患者肠道菌群功能多样性降低，对药物、必需氨基酸、丙酸盐等的代谢能力以及炎性反应显著增强，而对丁酸盐、胆汁酸的代谢能力以及细胞周期相关的功能显著降低。因此得出结论在肝硬化的影响下，肠道微生物的生长环境被破坏，肠道菌群为了适应环境，在功能和代谢方面表现出一定程度的代偿。
2.3.3 第二代基因测序技术在中药研究中的应用
Megan [43]等采用454焦磷酸测序技术对牙痛一粒丸等15种中成药中原料药材(包括植物药材和动物药材)进行了分子鉴定，结果表明叶绿体片段trn L可以用于中成药中植物类药材基原鉴别。何免[44]首先对经过传统高温水煎方法得到的甘草浸膏中是否含有miRNA进行鉴定，然后通过HiSeq高通量测序技术进行进一步验证，以证明甘草中是否存在稳定性很高的miRNA，同时也验证其中是否含有丰富的miRNA。结果表明甘草干燥药材水提物中miRNA的确存在，以及甘草miRNA对人免疫细胞的调节作用的发现，为我们提供了认识和研究甘草的一个新途径。进一步研究其miRNA的功用，将对甘草的作用机制研究和临床应用乃至甘草的剂型开发和新药研制带来新的思路。朱畇昊[45]采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术首次对山茱萸转录组进行了分析，并获得了山茱萸环烯醚萜类等次生代谢生物合成相关的候选基因，为山茱萸的分子生物学研究提供了丰富的数据资源，也为后续探讨候选基因的功能奠定了基础。
2.4第三代测序技术
现在，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该技术测定DNA序列更快，并有望进一步降低测序成本，改变个人医疗的前景[46-49]。第三代测序技术指Helico BioScience公司单分子测序技术(TIRM) ，Pacific Bioscience公司的单分子实时测序技术(SMRT)，以及Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术等。TIRM原理基于边合成边测序（SBS）技术，但不再依赖 PCR 扩增，简化了测序文库的构建。DNA模板与固体表面结合后边合成边测序，这样就可以避免DNA在扩增过程中出现错误。SMRT与TIRM测序不同的是，SMRT将四种dNTP 同时加入反应体系中，用零模波导（ZMW）的纳米结构[50]，光线在进入ZMW中会呈指数型衰减，只有靠近基质的部分会被保留，这可以很好地消除了背景荧光的干扰，同时也提高了测序速度。纳米孔单分子技术的原理发生了本质的变革，此技术不再局限于边合成边测序思想，而是把ssDNA 的末端利用外切酶切割成单碱基，然后进行后续的试验及检测，这一技术读长更长且使繁冗的后续拼接工作变得更为简便，还可以对未知基因组进行重新测序。第三代基因测序虽然有很多优点，但也不能忽视其错误率仍然较高，另外纳米孔单分子技术面临考验的是纳米孔器件承载膜太厚(空间分辨率不够)以及DNA分子穿孔太快(超过仪器的时间分辨率)[51]，而且该测序方法不能重复测序，这使得其结果不够精确。不过，单分子测序技术具有非常大的潜力，将来的市场发展前景广阔。
3总结与展望
在倡导中药现代化研究的今天，第二代测序技术由于其通量大、精确度高、速度快、低成本等显著特点正被逐步运用到中药研究的各个阶段。本课题组在研究甘遂毒性时，综合文献和前期研究得出：甘遂毒性作用部位与胃肠道密切相关。因此，采用基于16S rDNA基因的Hiseq测序技术，探讨给予甘遂各样品对正常动物肠道菌群结构的影响，构建给予甘遂各样品的正常动物肠道菌群结构多样性指纹谱（菌群结构信息），并采用UniFrac及PCA等多元统计方法研究给予甘遂各样品前后正常动物肠道菌群结构的差异，阐释甘遂各样品作用于正常动物肠道菌群结构变化的内涵，并比较甘遂不同活性成分（群）的作用差异，为研究甘遂醋炙减毒的生物学作用和物质基础提供一定的依据。但不可否认的是，第二代测序技术产生大量的数据结果，这些数据如何进行利用、储存、分析和传递，以及如何以生物知识对其解释和应用都存在一定难度。再者，第二代测序技术各平台读长仍然偏短，使得在测序前需将待测分子碎片化，后续分析须将这些碎片运用专业的数学理论方法拼接，这对普通科研人员而言较为困难。此外，虽然和一代测序相比，高通量测序的成本已经下降了许多，但每次测序仍会花费几千至上万元，这对于许多小型实验室来说有不小压力。而且第二代测序技术平台在制备文库时都不可避免需要进行PCR扩增，而PCR扩增这一过程很大程度上会使后续分析结果存在偏差。由此第三代测序技术发展起来，其一，第三代测序不需要进行PCR扩增，进一步提高了测序精确度；其二，虽然由于普及程度等原因目前第三代测序花费要高于第二代，但随着技术进步仍有望进一步降低成本[52]；其三，该测序技术读取长度长，可达几千个碱基，使得后续拼接更为容易。从这些优势来看，未来的几十年中，第三代测序技术有望逐步普及为一种常规技术。相信今后，各代测序技术发挥各自的优势，配合使用，在微生物、医学等领域如研究基因组与致病机制、描述新的微生物序列、个性化精准医疗等方面将会发挥更加重要的作用[53]。
参考文献
[1] 张险峰,甘遂的毒性及其解毒药理机制研究进展[J].中国医院药学杂志, 2014, 34(18):1611-1615.
[2] Xiao yun Shu, Li Yu, Yu ping Tang, et al. Bioassay-guided separation of the proinflammatory constituents from the roots of Euphorbia kansui[J]. J Nat Med, 2010, 64: 98103.
[3] Jing Gao, Lan Gao, Li Zhang, et al. 3-O-(2E,4Z-decadienoyl)-20-O-acetylingenol induces apoptosisin intestinal epithelial cells of rats via mitochondrial pathway[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2015, 174: 331338.
[4] Fangfang Cheng, Yanjing Yang, Li Zhang, et al. A Natural Triterpene Derivative from Euphorbia kansui Inhibits Cell Proliferation and Induces Apoptosis against Rat Intestinal Epithelioid Cell Line in Vitro[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16: 18956-18975.
[5] Li Zhang, Lan Gao, Zhengjun Li, et al. Bio-Guided Isolation of the Cytotoxic Terpenoids from the Roots of Euphorbia kansui against Human Normal Cell Lines L-O2 and GES-1[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13: 11247-11259.
[6] Zhou Yan, Jin Jun Hou, Peng Qi, et al. Colon-derived uremic biomarkers induced by the acute toxicity of Kansui radix: A metabolomics study of rat plasma and intestinal contents by UPLC-QTOF-MSE[J]. Journal of Chromatography B, 2015, 09, 022.
[7] Bing wen Tang, Jia jia Ding, Fu hai Wu, et al. 1H NMR-based metabonomics study of the urinary biochemical changes in Kansui treated rat[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 141: 134-142.
[8] 杨永霞, 唐冰雯, 丁佳佳, 等. 甘遂毒性的血浆代谢组学研究[J]. 第三军医大学学报, 2014 , 36(1):38-41
[9] 景欣悦, 彭蕴茹, 王新敏, 等. 甘遂与甘草合用对甘遂毒性成分甘遂萜酯A、甘遂萜酯B 代谢的影响[J]. 中国药理学通报,2015 ,31(1) : 136-140.
[10] 刘振波.DNA测序技术比较[J].生物学通报, 2012, 47(7): 14～17.
[11] 刘佶, 何宏, 刘蓬蓬.DNA测序技术进展及其应用[J].生命科学仪器, 2013(4): 21～25.
[12] 刘振宇.中国基因测序专利分析[J].高科技与产业化, 2016(7): 58～66.
[13] 解增言, 林俊华, 谭军,等.DNA测序技术的发展历史与最新进展[J].生物技术通报, 2010(8): 64～70.
[14] Wheeler DA, Srinivasan M, Egholm M, et al. The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing. [J].NATURE, 2008, 452(7189): 872～876.
[15] 谢浩, 赵明, 胡志迪,等.DNA测序技术方法研究及其进展[J].生命的化学, 2015(6): 811～816.
[16] Bian X, Z. E, Ma P, et al. Identification of miRNAs in sweet potato by Solexa sequencing[J]. RUSS J PLANT PHYSL , 2016, 63(2): 283～292.
[17] Su J, Liu X, Sun H, et al. Identification of differentially expressed microRNAs in placentas of cloned and normally produced calves by Solexa sequencing[J]. ANIM REPROD SCI, 2015, 155: 64.
[18] Liu X, Liu L, Zhang M, et al. Chicken cecal microRNAs in the response to Campylobacter jejuni inoculation by Solexa sequencing. [J]. POULTRY SCI, 2016: w190.
[19] Lee, JiAnn, Damianov, et al. Cytoplasmic Rbfox1 Regulates the Expression of Synaptic and Autism-Related Genes[J]. NEURON, 2016, 89(1): 113～128.
[20] Hodkinson BP, Grice EA. Next-Generation Sequencing: A Review of Technologies and Tools for Wound Microbiome Research. [J]. Advances in Wound Care, 2015, 4(1): 50.
[21] Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. [J].SCIENCE, 2005, 309(5741): 1728～1732.
[22] Wang L, He W, Mao J, et al. Development of a SNP-STRs multiplex for forensic
identification[J].Forensic Science International Genetics Supplement, 2015, 5: e598～e600.
[23] 贾琼莹.与疾病相关的SNP分型数据管理和分析平台[D].东南大学, 2015.
[24] 金武, 闻海波, 杜兴伟,等.暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9的SNP7271检测及其与性别相关分析[J].淡水渔业, 2016, 46(2): 99～102.
[25] Qu JY, Xi J, Zhang YH, et al. Association of the MicroRNA-146a SNP rs2910164 with Ischemic Stroke Incidence and Prognosis in a Chinese Population. [J].INT J MOL SCI, 2016, 17(5): 660.
[26] 张丁予, 章婷曦, 王国祥.第二代测序技术的发展及应用[J].环境科学与技术, 2016(9): 96～102.
[27] Hirsch J, Galidevara S, Strohmeier S, et al. Effects on diversity of soil fungal community and fate of an artificially applied Beauveria bassiana strain assessed through 454 pyrosequencing. [J].MICROB ECOL, 2013, 66(3): 608～620.
[28] Vaughan MJ, Nelson W, Soderlund C, et al. Assessing Fungal Community Structure from Mineral Surfaces in Kartchner Caverns Using Multiplexed 454 Pyrosequencing. [J].MICROB ECOL, 2015, 70(1): 175～187.
[29] Almazroui SS, Alsadi AM.454 Pyrosequencing and direct plating reveal high fungal diversity and dominance by saprophytic species in organic compost. [J].International Journal of Agriculture Biology, 2016, 18(1): 98～102.
[30] 钟进, 杨兴坤, 郭晓玲,等.高通量测序技术在无创性检测胎儿染色体非整倍性中的应用[J].国际遗传学杂志, 2015, 38(1): 18～23.
[31] Wang L, Huang W, Ren C, et al. Analysis of Serum microRNA Profile by Solexa Sequencing in Women With Endometriosis. [J]. REPROD SCI, 2016, 23(10): 1359.
[32] 张静娜, 王译葵, 蒋岩,等.高通量测序技术用于丙型肝炎病毒感染溯源调查[J].中华预防医学杂志, 2016, 50(6): 530～534.
[33] 马亮, 姜永玮, 王少婷,等.高通量测序在FLT3-ITD阳性急性髓细胞白血病患者中的应用[J].中国实验血液学杂志, 2016, 24(2): 381～387.
[34] Zhou M, Luo H. MicroRNA-mediated gene regulation: potential applications for plant genetic engineering. [J]. PLANT MOL BIOL, 2013, 83(1): 59.
[35] 左勇, 王小龙, 张晶,等.基于高通量测序技术的宜宾芽菜真菌多样性研究[J].中国调味品, 2016, 41(4): 19～22.
[36] 李琦, 张鹏, 尚晓泓.高通量测序在中草药研究中的应用[J].检验医学与临床, 2016, 13(s1): 314～316.
[37] Zhang C, Zeng K, Zhang L, et al. PLANT MICRORNA IDENTIFICATION AND APPLICATION THEREOF[J]. 2013.
[38] Cantacessi C, Giacomin P, Croese J, et al. Impact of experimental hookworm infection on the human gut microbiota[J]. J INFECT DIS, 2014, 210(9): 1431.
[39] Cooper P, Walker AW, Reyes J, et al. Patent Human Infections with the Whipworm, Trichuris trichiura, Are Not Associated with Alterations in the Faecal Microbiota[J]. PLOS ONE, 2012, 8(10): e76573.
[40] 虞结梅.454高通量测序技术应用于粪便中病毒的发现与分析[D].中国疾病预防控制中心, 2013.
[41] Qin J, Li Y, Cai Z, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. [J]. NATURE, 2012, 490(7418): 55.
[42] 魏晓, 邹大阳, 闫夏贝,等.肝硬化患者肠道微生物代谢功能的宏基因组学研究[J].军事医学, 2013(11): 801～807.
[43] Coghlan ML, Haile J, Houston J, et al. Deep Sequencing of Plant and Animal DNA Contained within Traditional Chinese Medicines Reveals Legality Issues and Health Safety Concerns[J].PLOS GENET, 2012, 8(4): e1002657.
[44] 何免.甘草水煎剂中miRNA的提取、高通量测序及对免疫细胞的影响研究[D]. 广东药学院, 2015.
[45] 朱畇昊.基于转录组测序的山茱萸次生代谢生物合成相关基因的挖掘[J].中国中药杂志, 2017, 42(2).
[46] 柳延虎, 王璐, 于黎.单分子实时测序技术的原理与应用[A].遗传多样性:前沿与挑战中国的遗传学研究[C].2015.
[47] 孙许龙, 李鹏洲, 杨湘武,等.基因测序技术在代谢外科治疗中的应用进展[J].中华肥胖与代谢病电子杂志, 2016, 2(2): 68～72.
[48] 尤永平.基于基因组学测序技术的精准医学脑胶质瘤的未来诊疗模式[J].中华神经外科杂志, 2016, 32(5): 436～437.
[49] 袁易, 王铭杰, 张欣欣.第三代测序技术的主要特点及其在病毒基因组研究中的应用[J].微生物与感染, 2016, 11(6): 380～384.
[50] Zhu P, Craighead HG. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis.[J].SCIENCE, 2012, 299(5607): 682.
[51] 王跃.基于纳米孔和纳米阵列的单分子DNA测序技术基础研究[D].上海交通大学; 2014.
[52] Huanga X, Barbeea K, Chena YJ, et al. Towards a $1000 human genome[J]. Nanomedicine Nanotechnology Biology Medicine, 2006, 2(4): 271～272.
[53] Kim W, Febbo PG.The current and future role of sequence-based analysis in prostate cancer treatment[J].PERS MED, 2017, 10(3): 257～273.
3. 设计方案和技术路线
研究方案：
取健康雄性SD 大鼠，按体重随机分为正常对照组，各正常给药组。正常对照组给予同体积0.5％CMC-Na 溶液，开展下述研究：
（1）样本采集
4. 工作计划
2022年1月2022年2月
查阅文献，了解第一、第二、第三代测序技术的基本原理及其在医药领域的应用，完成综述。
2022年3月2022年5月
5. 难点与创新点
作为毒性作用主要发生于胃肠道部位的中药，甘遂的毒性作用与人体肠道中重要共生微生物-肠道菌群的相关性尚缺乏系统研究，采用以高效、准确、高通量为特点的基于16S rDNA 的Hiseq 基因测序技术，探寻与甘遂毒性高度相关的肠道菌群结构，并比较甘遂不同活性成分（群）的作用差异，为研究甘遂醋炙减毒的生物学作用和物质基础提供一定的依据。
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