1. 研究目的与意义
内容：1.文献查阅及方案设计； 2.提取蝎毒素有效成分；将蝎毒素基因BMKNaTx2装入pTT5真核表达载体中并验证； 3.相关系列动物实验，验证毒素药用效果；大量提取上述蝎毒素基因质粒，将其转染HEK293细胞；4. 数据统计及材料撰写。
收取细胞表达上清，ProteinA亲和纯化后验证纯度；5.电生理活性初探。
意义：1.掌握查找文献的方法途径及文献的筛选；了解基因工程的基本原理。
2. 文献综述
东亚钳蝎毒素的研究进展殷旭东摘 要：综述了东亚钳蝎蝎毒素的主要成分、应用效果、药用价值等与蝎毒素相关的介绍。关键词：蝎 毒素 进展1引言 动物毒器是有毒动物为了自我保护而进化出的器官，其产生的多肽毒素自然成了它们防守与进攻的有利手段。这些毒素具有高活性及很强的专一性，可以针对某些膜通道与受体作用从而破环组织和细胞。因此，它们的进化速度也是相当惊人，这也就促成了它们基因的丰富性和分子水平上的生物多样性。加上地域与相关条件的限制造成的结构与功能的特殊性，多肽毒素可以说是相当活跃的天然药物资源[1]。2蝎毒素介绍 东亚钳蝎属节肢动物门，蛛形纲，蝎目，正钳蝎属，毒液由尾腺分泌，毒性较弱。毒液中多肽成分主要以一类由20-80个氨基酸残基的小分子多肽为主，非蛋白成分则含有脂类、有机酸、微量元素等。这些毒素按受体分为：Na 通道、K 通道、Cl-通道和Ca 通道。这些离子通道是细胞膜表面一类大分子跨膜糖蛋白，可进行细胞内外离子交换，也可产生或传导电信号。当蝎毒素与其结合时，通道电流会发生阻断或改变。近年来,通过对快速Na 通道进行了广泛的研究, 采用电生理方法,已鉴定出这种通道的五个分离的受体位点, 它们分别与五类专一性不的毒素相互作用。其中, 位点3可结合α型蝎毒素, 位点4结合β型蝎毒素。α型蝎毒素通过钝化Na 通道的失活过程而延长动作电位, 它与受体的结合依赖于膜电位, β型蝎毒素通过降低Na 通道的激活电位而使动作电位反复发放, 它与受体的结合不依赖于膜电位。如果对纯化的β型蝎毒素进行标记, 带标记的蝎毒素就能作为探针, 它除了可以用于研究Na 通道受体的发生、发育和衰老外, 还可以用于分离纯化Na 通道的受体蛋白[10]。因此蝎毒素具有重要生理功能[2]。3蝎毒素的昆虫专一性 在对蝎毒素的不断研究下，科学家们发现其中含有一种昆虫专一性神经毒素，以小分子量与昆虫神经细胞膜的离子通道特异性结合，从而使昆虫的机体陷入瘫痪。这种昆虫毒素为一类碱性蛋白，并且具有较强的稳定性，并且根据分子量大小分为长链和短链。长链通常还有60-70个氨基酸残基，分子量在7000Da左右。它的分子内含4对二硫键，3对与哺乳动物神经毒素一致，但唯一一对二硫键的改变却引起了分子构型上的变化，也就导致了它对哺乳动物不具有药理活性，而对昆虫有药理活性的专一性能。短链则含有30-40个氨基酸残基，是可以影响离子通道的一类多肽毒素。在已被分离纯化的东亚钳蝎毒昆虫毒素中，目前已测定出BmⅪT、BmKIT2、BmKIB、BmKIT4、BmKITAP、BmKdIAP3、Bm．12完整的蛋白质一级结构，以及东亚钳蝎昆虫毒素分子氨基酸序列及东亚钳蝎部分昆虫毒素的cDNA序列[3]。由于蝎毒素对昆虫的强专一性，通常被应用于昆虫生物毒素类杀虫剂的研究领域。通过以麻蝇幼虫和德国小蠊等为实验对象进行FP型毒素与CP型毒素比较，发现FP型毒素相对CP型毒素毒性较低，含量高，并且基因趋向异化明显，所以FP型毒素可能是较古老的昆虫神经毒素，而CP型毒素为新进化具有较强生物活性的昆虫神经毒素[4]。在导入毒素基因后的转基因植物会对进食它的昆虫造成一定的伤害，但目前致死率还并不明显。因此我们还需要对毒素在昆虫体内的作用途径进行研究，了解毒素如何通过进食来到达神经细胞并破坏，从而有针对性地改进转基因植物来提高致死率。另外，我们也要避免改造的毒素基因对非目标生物的不良影响，以及基因合适的转入方式来提高基因的表达量。最后，还要选择合适的启动子，保证表达在害虫的进食部位，也可以更好地减少转基因植物对非目标生物的影响[5]。4 蝎毒素的哺乳动物专一性 已测定组成的哺乳动物毒素大约有四十种。它们是一类氨基酸数目为50-78，仅由一条肤链构成的碱性蛋白质。所有这些哺乳动物毒素都是神经毒, 它们大部分有四个二硫桥。蛇毒神经毒大部分也有四个二硫桥, 但二硫桥位置不同。而且这两类神经毒素不能交叉免疫。这二者结构的不同显然也反映了对哺乳动物的作用方式不同[9]。5 蝎毒素的药理作用5.1抗肿瘤作用研究表明，东亚钳蝎毒素中含有一种抗癌多肽（APBMV），可选择性地杀伤肿瘤细胞，诱导其凋亡，并减轻化疗副作用，提高正常组织的免疫活性。根据相关文献的资料，董伟华等以APBM-V不同浓度处理4种肿瘤细胞人早幼粒细胞白血病细胞株HL一60、人肝癌细胞株SMMC一7721、人低分化鼻咽上皮癌细胞株CNE一2Z和人胃癌细胞株MGC一803，其中对HL-60和SMMC-7721的作用比后两者显示出更好的量效关系。结果显示APBMV对以上癌株均有显著的细胞毒性和生长抑制作用，其中对HL一60细胞的生长抑制作用以48h为显著，还可显著抑制SMMC一7721和MMC-803细胞的集落形成。另外还对小鼠肝癌H22细胞、小鼠黑素瘤B16移植瘤抑制效果显著。有学者证实，蝎毒素对ECA109细胞生长和集落形成有明显抑制作用，但对Hela细胞的抑制作用不明显。这就说明它有一定的肿瘤谱，而并非对所有肿瘤均有杀伤与抑制效果。临床上蝎毒素用于治疗大肠癌，治疗后发现肿瘤组织癌胚抗原染色能力显著降低；增殖细胞核抗原阳性半定量分级降低；患者排便习惯明显改善。可见蝎毒对直肠癌有显著抑杀作用。虽然目前蝎毒素抗肿瘤机理还尚不明确，但根据相关临床结果可以猜测蝎毒素能抑制细胞线粒体生物氧化酶活性，从而导致细胞代谢缓慢，生长受到抑制。另外它可与肿瘤细胞DNA特异性结合造成DNA断裂，有效控制肿瘤细胞增殖[7]。5.2 抗炎作用 通过蝎毒素对大鼠佐剂性关节炎的作用推断蝎毒素对同为局部急性炎症反应的类风湿关节炎的治疗效果。结果表明蝎毒对急性渗出性炎症作用明显，对慢性增生性炎症有一定作用，但对以变态、过敏反应为主的一些炎症则作用不明显。5.3 镇痛作用 研究发现蝎毒的分离组分具有明显的中枢镇痛作用，其机制在于蝎毒通过大鼠中脑导水管周围灰质起作用，且镇痛作用较吗啡强10倍。韩雪飞[6]等改进传统两步柱层析法，采用一步柱层析法，成功地从粗毒中分离纯化了镇痛活性肽，由此进一步证明了蝎毒的镇痛作用。5.4 抗癫痫作用 通过相关实验表明，蝎毒有明显抑制癫痫发作敏感性的作用，减少全身性的兴奋性氨基酸，减弱敏感性，并可抑制海马硬化。5.5 纤溶作用 研究发现，蝎毒纤溶活性肽用药后10min和4h的不同浓度都能使tPA(纤溶酶原激活剂)活性增强，PAl一1(纤溶酶原激活抑制物)活性降低，从而加大tPA／PAI一1比值，加强抗栓、溶栓作用。5.6 对心率的抑制作用 蝎毒中的抗癫痫肽(AEP)能减少豚鼠离体心脏的收缩力，对心率具有强烈的抑制作用，这种作用是可逆的，如用任氏液冲洗后心跳可恢复。电生理表明，抑制型毒素可通过封闭动物组织的轴突离体标本上的诱发动作电位，降低峰钠电流，进而逐渐抑制钠电流。因此，蝎毒可能通过对钠通道的作用，使得心率减慢或停跳。5.7 改善血液流变性 宋益民等对蝎毒活性肽对兔血液流变性的影响进行了观察，结果表明蝎毒活性肽可明显抑制血小板聚集，降低Fib水平，降低红细胞聚集性，提高红细胞变形能力，从而降低Pv和HcT。可以得出，蝎毒通过降低血液粘度而改善血液流变性的结论[8]。6 未来展望自然动物毒素的作用仍在开发，蝎毒素也不例外。可能在未来的五到十年，蝎毒素在医学神经学方面以及分子生物学方面会有重大进展。
参考文献[1] 湖南师范大学生命科学学院，梁宋平，《动物多肽毒素及其药物学研究》，湖南师范大学学报（医学版），2012，9（1）[2] 湖北孝感学院生命科学技术学院，盛继群，《蝎毒素成分、应用价值及其研究进展》，孝感学院学报，2004年11月[3] 陕西省动物研究所，唐周怀，陈川，石永强，《东亚钳蝎昆虫毒素研究进展》，华东昆虫学报，2005,14（1）[4] 武汉大学生命科学学院，韩亚娟，吴文哲，谢家政；武汉大学基础医学院， 蒋洪，《新型杀虫剂昆虫生物毒素的研究进展》，第27届全国卫生杀虫药械学术交流暨产品展示会资料汇编[5] 沈阳农业大学生物技术学院，辽宁省植物基因工程技术研究中心，承德市农业科学研究所，阮燕晔， 王波， 崔振海， 栾素荣，《抗昆虫蝎毒素及其在植物遗传转化中的研究进展》，植物保护2011，37(4)：1217[6] 韩雪飞，徐霞，申庆红等，《蝎毒素Ⅳ分离纯化研究》，河南医科大学学报，1996。31(3)：114．[7] 沈东海综述，高春芳，王元禾，王强审校，《蝎毒抗肿瘤作用研究进展》，实用医药杂志2005年5月第22卷第5期[8] 黑龙江中医药大学，张乔，赵文静，旺建伟，《蝎毒的药理作用和临床应用研究进展》，ITCM．Mar．2006，V01．23，NO．2[9] 沈阳药学院制药系生化教研室)，周新华，《蝎毒的生化研究及临床应用》[10] 武汉大学资源开发与应用技术研究所，郑连爽，《蝎毒素应用研究进展》
3. 设计方案和技术路线
1.重组真核表达载体的构建；2.分泌型毒素多肽的表达和纯化；3.电生理活性检测。
4. 工作计划
2022年1月~2月 查阅相关文献，对研究内容进行初步了解学习，掌握基本实验操作技能。
完成开题报告。
2022年3月~4月 进行东亚钳蝎多肽毒素BMKNaTx2的重组制备与表达。
5. 难点与创新点
1.从转录组学数据出发，利用同源比对和建模预测可能的活性蛋白；2.使用真核表达载体进行分泌型蛋白表达，并以Fc标签作为纯化靶点。
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