1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、课题意义：油菜是世界上重要油料作物之一，是世界食用植物油的重要来源。近十年来，随着其种植面积的不断扩大，国内油菜在 2010 年的播种面积达到了 737 万公顷，而油菜籽的年产量近年来稳定在1 300万吨左右，占油料总产量的 40% 以上［1］。菜籽油在食用油当中占据了一个越来越重要的位置，目前已成为世界第二大植物油来源，因此提高油菜种子含油量具有重大的经济利用价值。 我们研究的是油菜LEC1-Like基因家族调控油脂合成方面的功能分析。Leafy Cotyledon ( LEC )基因是最先在拟南芥中发现的一种发育调控基因[2] , 在植物胚胎发生过程中的形态建成和成熟两个阶段均起着重要作用。在胚胎发育早期, LEC 基因决定胚柄细胞的命运; 在胚胎成熟阶段, LEC 基因决定许多与成熟有关基因的表达, 并使种子获得对脱水的耐受性[ 3] 。对拟南芥研究发现, LEC 基于三个基因座位的突变可分为LEC 1、LEC 2和FUSCA3 (FUS3)三类[ 4] , LEC 1是一个编码与CCAAT 序列结合的转录因子[ 5] , LEC 2和FUS 3则都是编码具有B3 结构域的转录因子[ 6 - 8] ,此外, 在拟南芥中还克隆出与LEC 1有很高同源性的LEC1- LIKE (L1L)基因[ 3]。 Mu 等[9]的研究表明，拟南芥 LEC1 基因的过表达导致脂肪酸合成基因表达量整体水平的增加，而这些基因参与缩合、碳链延伸、去饱和化等脂肪酸合成中的关键反应，在 LEC1 过表达的转基因植株中，超过 58%已知的参与质体脂肪酸合成途径的酶基因表现出正调控，包括编码乙酰辅酶 A 羧化酶（控制脂肪酸合成的关键酶）3 种亚基的基因。参与糖酵解和脂质积累的基因也出现上调。同时，转基因植株中，主要脂肪酸的种类和脂质的水平大幅度增加，另外，在拟南芥中过表达的2 个油菜 LEC1-like 基因，也出现相似的结果。LEC1 基因不仅是拟南芥胚形成的重要调控因子，也是控制种子成熟的重要调控因子[10]。本试验旨在研究油菜LEC1-Like 基因在油菜中的表达规律及其对油菜含油量的调控。L1L与LEC1属于同一类型的NF-Y转录因子。Kwong等人报道L1L基因能互补lec1突变体的表型，表明L1L在胚胎发育过程中具有与LEC1类似的功能。Mu等人用诱导表达系统研究发现过量表达LEC1、L1L基因能显著提高幼苗中脂肪酸的含量，表明LEC1、L1L在种子成熟过程中是调控脂肪酸合成和积累的关键因子。
CCAAT盒是一个广泛存在于基因启动子上的顺式作用元件，与CCAAT序列结合的转录因子又称为nuclear factor Y (NF-Y)或CCAAT binding factor (CBF)。NF-Y是一个由三种不同亚基构成的异源三聚体复合物，它特异性地识别DNA上的CCAAT序列，并与之结合，从而调节基因的表达。NF-Y的三种不同亚基分别属于3个亚族：NF-YA（又称为HAP2或CBF-B），NF-YB（又称为HAP3或CBF-A）和NF-YC（又称为HAP5或CBF-C）。NF-YB和NF-YC的核心结构域在序列上与组蛋白H2A和H2B有很高的同源性。NF-YB/NF-YC形成一个紧密结合的异源二聚体复合物，NF-YA再结合在这个复合物的表面，形成异源三聚体复合物。该三聚体复合物对DNA有很高的亲和力。
编码NF-Y亚基的基因普遍存在于真核生物中，其中在酵母与动物体中，各种亚基都是由单基因编码的。而在植物的基因组中，NF-Y亚基是由多种不同基因编码的。
2. 研究的基本内容和问题
一、研究目标： LEC1-LIKE (L1L)基因是植物合子胚和体细胞胚发育的关键基因之一，我们先前研究发现油菜BnL1L-1在调控油菜种子油脂合成过程中发挥重要的作用。本研究拟对四倍体油菜BnL1L基因家族进行克隆，并进行功能验证和表达模式分析。期望通过本次研究揭示LEC1-LIKE基因家族功能功能差异，探索其调控油菜种子油脂合成的作用机制，为今后通过分子手段提高油菜种子含油量提供靶标基因。二、研究内容：1.油菜BnL1L基因的克隆及生物信息学分析
通过生物信息学分析所研究基因是否属于LEC1家族,预测其亚细胞定位,分析其相应生物功能。
2.油菜BnL1L在不同含油量油菜种子发育期的表达分析
3. 研究的方法与方案
一、研究方法：本实验拟采用用BnL1L基因特异引物克隆目的基因，利用生物信息学软件分析BnL1L基因的进化机理，通过QRT-PCR方法检测油菜籽在受精后不同时期BnL1L基因的及作用机理。二、技术路线：
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三、实验方案：（1）分离鉴定BnL1L基因 根据不同区段的序列设计兼并引物进行同源克隆，分离油菜基因组中BnL1L同源基因。（2）进化分析 克隆获得的BnL1L基因序列，通过MEGA5等生物信息学软件对油菜BnL1L基因的数量、物理位置、系统进化树及氨基酸序列等进行分析。（3）基因表达模式分析 通过QRT-PCR定量检测分析BnL1L在种子不同发育时期的表达模式。 四、可行性分析 1、技术方法可行，在前期的研究中，我们对已克隆到的BnLEC1基因在油菜籽的表达情况用QRT-PCR方法进行了大量检测。该方案所采用的技术方法我们都已掌握，完全可以进行此项工作。 2、设计思路合理，实验之前，已通过大量的文献资料证实，十字花科植物的其他基因已通过该种方法进行了进化分析和表达量分析，且实验结果有利用价值。 3、实验条件具备。本毕业实习实验室属于作物遗传与种质创新国家重点实验室，具备相应的PCR仪、RNA反转录试剂盒等试验仪器和试剂。
4. 研究创新点
五、特色或创新之处期望通过本次研究揭示LEC1-LIKE基因家族功能功能差异，探索其调控油菜种子油脂合成的作用机制，为今后通过分子手段提高油菜种子含油量提供靶标基因。
5. 研究计划与进展
六、研究计划及预期进展 2014年6月-10月：根据不同区段的序列设计兼并引物进行同源克隆，分离油菜基因组中BnL1L同源基因； 2014年10月-2015年2月：种植转基因油菜材料； 2015年2月-4月：做相关实验，整理数据，撰写毕业论文。
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