1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
低温、干旱、高盐等非生物胁迫是限制农作物生长、生产的重要因素。水稻是我国重要的粮食作物，水稻生产每年都受到不同程度的非生物胁迫的影响，培育水稻抗逆品种是解决上述问题的重要方法。利用基因工程技术对水稻品种进行遗传改良无疑是培育水稻新品种有效、快捷的途径。因此进一步了解植物耐逆机理、挖掘和克隆抗逆基因显得尤为重要。
锌指蛋白（zincfingerprotein）是一类具有手指状结构域的转录因子（Takatsuji etal.,1998），通过结合Zn2 来稳定一种很短的可自我折叠成手指的蛋白结构。TFIIIA型锌指蛋白具有Cys2/His2型锌指结构(Mathieuetal.,2003)，其锌指区保守序列为：CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H（黄骥和张红生，2007）。目前已经报道的TFIIIA型锌指蛋白主要参与植物的生长发育以及植物逆境胁迫应答反应（黄骥和张红生，2007）。ZFP182基因是本实验室通过基因芯片技术鉴定的受各种非生物胁迫诱导后，基因表达增强幅度最大的一个TFIIIA型锌指蛋白基因，其在水稻抗逆性反应中发挥了非常关键的作用。
蛋白质的泛素化修饰在细胞生命活动过程中发挥了至关重要的作用，已经发现在植物中参与了植物的生长发育以及生物胁迫与非生物胁迫的响应(SmalleandVierstra，2004;Vierstra,2009)。蛋白质的泛素化修饰主要发生在赖氨酸残基的侧链，包括单泛素化和多泛素化过程。三种关键酶共同介导了蛋白质的泛素化过程，包括泛素活化酶El，泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。El通过其活性中心活化单个游离的泛素，然后El将活化的泛素递交给E2，最后由E3识别特异的底物蛋白并介导泛素从E2转移到靶蛋白。种类多样的E3泛素连接酶可使其对特定的蛋白质进行修饰，因此E3是在底物蛋白的特异性选择修饰过程中作用最为关键（Mazzucotelli etal.,2006）。根据E3的结构和功能，可以分为含有HECT(homologousto E6-APcarboxy-terminus)结构域E3和含有RING(really interestingnewgene)finger/U-box结构域E3(SmalleandVierstra，2004)。RING结构域已被证实是RINGE3泛素连接酶活性所必需的（Stoneetal.,2005）。根据拟南芥基因组资料，已经在拟南芥中已经发现了499个RINGE3泛素连接酶基因（Mazzucotelli etal.,2006），其中只有20多个拟南芥RINGE3泛素连接酶的功能进行了研究，而其他植物中的RINGE3泛素连接酶的功能报道还很少。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：探讨阐明水稻E3泛素连接酶ZFIP1在水稻抗逆反应中的基因工程应用价值。
研究内容：比较不同类型转基因植株的抗逆性，探讨ZFIP1在水稻抗逆性基因工程改良中的价值。为了验证ZFIP1是否具有作物抗逆性基因工程应用价值，ZFIP1-RNAi转基因植株幼苗进行高盐、低温和干旱耐逆性研究，通过逆境胁迫下植株的存活率计算以及各种生理生化指标的测定对转基因植株的抗逆能力进行评价，同时期望能够筛选出具有强耐逆能力的水稻转基因株系。
拟解决的关键科学问题：锌指蛋白与E3泛素连接酶在植物抵御非生物胁迫过程中均起着重要的作用，它们在非生物胁迫下的作用机制仍不清楚，本研究解决的关键问题是：（1）阐明水稻抗逆关键基因ZFIP1在水稻抗逆反应中的作用机理；（2）探讨利用植物E3泛素连接酶的进行作物抗逆性基因工程改良的可行性。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
水稻转基因植株的获得：构建35S:ZFIP1以及ZFIP1的RNA干涉表达载体35S:ZFIP1-RNAi等植物表达载体，通过本实验室建立的农杆菌介导的水稻转基因方法（郭书巧，2006，南京农业大学博士学位论文）分别转化水稻品种中花11。获得的转基因植株T0代进行PCR、Southern杂交等分子检测；繁殖加代后（包括海南加代繁殖）取T2代转基因植株进行后续研究。
转基因植株的表型和耐逆性分析：利用肉眼观察、光学显微镜、扫描电镜等检查手段对转基因植株的表型进行分析；通过田间栽培和实验室水培等方式对转基因植株在不同浓度盐处理条件下、低温处理条件下以及干旱处理调节下进行耐逆性评价（包括不同盐浓度、温度和甘露醇等处理条件下转基因植株的发芽率、处理前后转基因植株幼苗的叶片叶绿素含量、鲜重、渗透调节物质的含量等生理指标的测定）。
4. 研究创新点
特色或创新之处：
我们前期的工作已经证实了锌指蛋白基因ZFP182具有重要的抗逆功能；而E3泛素连接酶ZFIP1的作用可能是介导ZFP182的泛素化。因此，首先我们通过构建ZFIP1的过表达和干涉载体，获得相应转基因植株，进行ZFIP1的抗逆机制研究，从而更深入的解释ZFIP1在ZFP182介导的水稻抗逆途径中的作用。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2012.07-2013.09设计实验，培育转基因水稻苗，并按计划对实验组进行抗旱、抗寒胁迫处理，获得与逆境表型相关的数据。
2013.10-2013.11对转基因植株进行表型分析和耐逆性评价。
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