1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义：
干旱不仅对植物生长和发育有着严重影响，同时也是限制作物产量的主要逆境因子之一。世界上约有1/3的地区属于干旱和半干旱区，中国干旱半干旱地区约占国土面积的1/2。据统计，全球每年因干旱导致的作物减产高达20%。因此，增强植物的抗旱能力、培育耐旱品种对提高作物产量具有重要意义。由于干旱对农业生产有着十分显著的影响，因此人们采取了多种途径提高小麦对干旱胁迫的耐性，其中干旱锻炼是较为常见和高效的栽培措施之一。干旱锻炼是将植物预先进行短期致死或亚致死剂量的干旱胁迫，以提高植物应对后期干旱逆境的适应能力的方法。HO是活性氧(ROS) 的一种, 多种外界刺激或细胞内信号分子都可以导致细胞HO的积累。HO可以作为信号分子, 在气孔运动、生物和非生物胁迫应答、细胞程序性死亡、激素应答以及生长发育调控过程中起重要作用。因此对HO在干旱锻炼提高小麦耐旱性中的作用机制的研究具有重要理论价值。
国内外研究进展：
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
1、 明确干旱响应的表型差异。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1、叶片水势：
取一叶叶片，剪切后放入样品杯，将装有样品的样品杯放入校准后的WP4C露点水势仪中进行测定，室温控制在25℃，每个处理3次重复，每个重复测定3次。
2、叶面积及叶片生物量积累
分别于干旱锻炼后、干旱胁迫后进行取样，使用叶面积仪(型号为Li-3000，美国Li-cor生产)测定小麦单株叶面积；然后进行鲜重测定，装入信封105℃杀青15min，75℃烘干至恒重，测定干重，每个处理测定3个重复。
3、光合参数测定
小麦顶展叶光合特性相关参数测定使用Li-6400（Li-Cor Inc，USA）便携式光合作用测定系统。测定时间为天气晴朗的上午9:00-11:30之间，测定时仪器采用开放式气路，光源为红蓝光源，CO2浓度为380μmol/L，仪器的光合有效辐射为1000μm·m-2s-1，相对湿度设置为50%，选取顶展叶/旗叶（干旱胁迫后为旗叶）位置相同且向光的部位测定，每个处理选取5个重复。4、可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱含量测定
可溶性糖含量测定采用硫酸-蒽酮比色法，脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮显色法。
样品提取：干样0.1g，加入8mL浓度为80%的乙醇于10mL离心管中摇匀，80℃水浴30min，3000r离心10min，倒出上清液，总共提取3次，定容到25mL试管中。
可溶性糖的测定步骤：吸取0.1mL提取液，加入5mL蒽酮硫酸溶液，90℃保温15min，冷却后溶液呈蓝绿色，于620nm处比色。
脯氨酸的测定步骤：吸取2mL提取液，加入3mL茚三酮溶液，0.1mL 0.1%（w/v）的抗坏血酸溶液，盖上玻璃塞后沸水浴15min，摇动下冷却15min，60%的乙醇溶液定容至5mL，溶液呈深蓝色，于570nm处比色。
甜菜碱含量测定参照NY/T 1746-2009标准进行。称取烘干叶片粉末0.2g，加入8ml蒸馏水，室温震荡3h，离心取上清液。上清液用盐酸调pH至1.0±0.1，抽滤，定容至10ml。吸取3ml提取液于离心管中，置于4℃冰箱中存放15min,加入雷氏盐溶液(15g/L)5 mL，再置入冰箱存放1 h。取出用10000 r/min离心15 min，弃上清液，于通风橱中加入99%的乙醚溶液5mL，充分摇匀后离心。置于通风橱中使乙醚挥发至干，加入5ml 70%丙酮溶液，摇匀，525nm处测定吸光值。配制一系列浓度甜菜碱溶液同步测定做标准曲线。
5、ABA 和HO含量测定
ABA含量测定用反式超高效液相色谱(UPLC)技术。
样品提取和纯化：将样品(0.5g小麦顶展叶)放到预冷的研钵中，加人5mL预冷的50%色谱甲醇（v/v），（弱光）冰浴研磨成浆，4℃下浸提12h，4℃下10,000r/min离心10min，取上清液保存于4℃冰箱中，残渣先加入预冷50%色谱甲醇2mL提取，间隔12h，离心(条件同上)，收集上清液后再向残渣中加入预冷50%色谱甲醇2ml提取12h，同上离心，收集合并全部浸液；将提取液按0.2g/g FW加入PVPP吸附酚类物质及色素，在摇床上4℃振荡60min，摇匀，同上离心，将上清液缓慢过C18小柱（先用2-5ml 50%色谱甲醇润洗，然后过样品，最后再以5ml 50%色谱甲醇梯度洗脱），流出液倒入25ml塑料小烧杯中，放入冷冻干燥仪中避光进行冷冻干燥，结束后取出加入3ml 50%色谱甲醇溶解，过0.22μm有机系超微滤膜，待测。
标准品配制：将标准品ABA用50%甲醇进行溶解，配置成一系列浓度，用峰面积(Y)对浓度(X，ug/ml)做线性回归方程，进行计算。
仪器与试剂：高效液相色谱；超纯水纯仪Synergy，试验用水均为超纯水；C18小柱为Agilent公司生产，规格为500mg 6ml；冷冻干燥机；摇床(QHZ-98B)；0.22μm有机系超微滤膜等。激素标样：ABA为Sigma公司生产；甲醇为科密欧公司生产色谱纯；聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)为Solarbio公司生产。
HO含量测定采用试剂盒法。
6、荧光定量PCR（qRT-PCR）
取新鲜小麦顶展叶和根系100mg，在经高压灭菌的研钵中加液氮充分研磨，然后采用RNA提取试剂盒TrizolReagent（Invitrogen, San Diego, CA）按照试剂盒说明书进行提取。首先用1.2%琼脂糖凝胶电泳测定提取的RNA的完整性，电泳后可清晰看到明显的28S和18SrRNA条带；其次，测定RNA样品在OD260和OD280的吸光值，用于RNA质量检测（比值范围1.8均高于1.95），同时测定样品RNA的浓度，质量检测合格后的RNA参照Super Smart cDNASynthesis Kit（Takala）的说明，以OligodT为引物，经反转录合成cDNA。
以反转录产物cDNA为模板，分别采用表1中所列引物，使用SYBRGreen Ι Master mix（Takara）试剂盒及其操作步骤进行PCR，各个基因的退火温度均优化为60℃，根据操作步骤在ABI PRISMTM7300快速荧光实时定量PCR仪上进行荧光相对定量。荧光相对定量的计算方法采用-ΔΔCt，计算公式为2-ΔΔCt=2-[ΔCt(处理)- ΔCt（对照）] -2-[(ΔCt (处理)- ΔCt (Actin))–(ΔCt（对照）-ΔCt(Actin))] ，其中Ct是指目的基因达到阈值时的循环数。试验包括3个重复。
表1 荧光定量PCR引物序列
Table 1 Primers used for real time quantitative PCR
| 基因名称 | 正向引物序列 | 反向引物序列 |
| Gene | Forward primer 5’-3’ | Reverse primer 5’-3’ |
| Actin | GACGCACAACAGGTATCGTGTTG | AGCGAGGTCAAGACGAAGGATG |
| NCED1 | CCCAGCACTAATCGATTCC | CCGCTAACTGTATCCATGC |
| NCED2 | GGAGATGGAAAGAGGAAGTCG | GAAGCAAGTGTGAGCTAAC |
| Rboh | TGTTCAATGTCCAGCAGT | GTGTCCAGTCACCAAGTT |
| CPK | CAAGCGCAAGCTGCTGTG | TGACAATGTGCACGAAGAGCG |
| MAPK | GAGTTACGGCGTGGTCTGCTC | GCGGAGTATCCGTGTCGCATC |
| MAPK2 | CGCCACTGCCACCTCTCA | GCACCACCTCACCACCCA |
| P5CS | GAGACAAGTCCCGTGTTGGT | CACTGGTCTCCTTGGATGG |
| PDH | GTGATGGGACGGGAGTGAGGA | CAACAGCGTTATTTCGTTTATTCCA |
| BADH | GGCTGGGTTCAGTCATCAGT | CCAAATTTGCATTGATGTGC |
| RcaB | ACACGATGGCTTCTGCTTTCT | GCCCTGACCACCCTATTGTT |
| Cab | TTCCACACACTCAAGCCACAC | CGAAGGACGAAGAGGAAAGAGA |
7、数据采用 SPSS 软件进行分析和显著性差异检验，作图使用 Sigmaplot12.5作图软件。
技术路线：
实验方案：
试验设计：本试验选用品种扬麦16进行水培试验。选取大小一致，籽粒饱满的小麦种子放入浓度为15%的过氧化氢溶液中浸泡10 分钟，进行表面消毒，待浸泡结束后用蒸馏水充分清洗干净。将种子均匀放置于中转箱中，加入适量蒸馏水放置于光照培养箱中使其充分吸胀，培养条件为：温度为 20℃，相对湿度为75%，不进行光照，待幼苗一叶一心时，选取长势均匀一致的幼苗移植在水培周转箱中，培养的营养液选用 Hoagland 营养液，待正常培养的小麦幼苗三叶一心时进行处理，分别设置喷施H2O，喷施H2O 干旱锻炼；喷施DMTU，喷施DMTU 干旱锻炼；喷施DPI，喷施DPI 干旱锻炼；喷施FLU，喷施FLU 干旱锻炼。在幼苗三叶一心期进行外源物质喷施，所用外源物质及浓度分别为：（1）清水对照；（2）5mM N，N-二甲基硫脲（DMTU，HO 清除剂）；（3）100μM二苯基氯化碘盐（DPI，NADPH氧化酶抑制剂）；（4）1μM 氟啶酮（FLU，ABA 合成抑制剂）；喷施溶液含有 0.1%的乙醇（能够溶解ABA 的最少含量）和 0.002%的吐温 20%，每天清晨和傍晚进行喷施，连续喷施2天。喷施处理结束 2d后进行干旱锻炼（10%PEG6000）处理，处理1d 后恢复 10d，再次进行干旱胁迫处理，胁迫2~3d 后测定指标，分别在干旱锻炼和胁迫后取样分析。
试验处理如表2，CK 为正常对照，CD 为干旱对照，DMTU-CD、FLU-CD和DPI-CD处理为外源干旱对照，设置DMTU-PD处理为了清除干旱锻炼过程中HO的合成，DPI-PD 处理为了抑制干旱锻炼过程中HO的产生，设置FLU-PD 处理为了抑制干旱锻炼过程中ABA的合成。
表 2 试验处理
Table 2 Experimental treatments
| 处理 | 第一次喷施 | 第二次喷施 | 喷施2天后处理 | 恢复10天后处理 |
| CK | 蒸馏水 | 蒸馏水 | / | / |
| CD | 蒸馏水 | 蒸馏水 | / | 干旱胁迫 |
| PD | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 干旱锻炼 | 干旱胁迫 |
| DMTU-CD | DMTU | DMTU | / | 干旱胁迫 |
| DMTU-PD | DMTU | DMTU | 干旱锻炼 | 干旱胁迫 |
| DPI-CD | DPI | DPI | / | 干旱胁迫 |
| DPI-PD | DPI | DPI | 干旱锻炼 | 干旱胁迫 |
| FLU -CD | FLU | FLU | / | 干旱胁迫 |
| FLU -PD | FLU | FLU | 干旱锻炼 | 干旱胁迫 |
测定指标有表型指标（叶片水势、叶面积、叶片生物量、气孔密度、气孔开度、光合参数）、渗透调节物质（可溶性糖、甜菜碱、脯氨酸）含量、信号物质ABA含量及HO含量，同时测定脯氨酸、甜菜碱、HO相关基因的表达。测定方法见研究方法。
可行性分析：
指导老师在小麦逆境生理方面的研究经历与学术积累，为本项目的顺利开展奠定了良好的基础。试验涉及的各种操作以及测定方法均为本实验室较为成熟的方法，且实验室具有较好的逆境生理研究基础。师姐有着丰富的相关经验和数据分析处理能力，能够给予我正确细心的指导和帮助。综上所述，本项目的主要研究内容和手段具有较好的研究基础和理论依据，是切实可行的。
4. 研究创新点
创新之处：
通过外源喷施NADPH氧化酶抑制剂及HO 清除剂探究了信号物质HO在干旱锻炼提高小麦耐旱性的可能信号转导途径。这一机制的明确对大田生产中研发相关抗旱诱导剂具有十分重要的指导意义。5. 研究计划与进展
研究计划：
2018年7月12日-7月20日 查阅文献资料，进行理论知识学习。
7月23日-8月3日 种子发芽至移苗。
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